Nařízení Komise (EU) 2017/735 ze dne 14. února 2017, kterým se přizpůsobuje technickému pokroku příloha nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (Text s významem pro EHP. )

Tento náhled textu slouží k rychlé orientaci. Formátovaný text a další informace k předpisu nařízení 735/2017/EU najdete na stránkách systému Eurlex, který je provozovaný Evropskou unií.
   
               
               
                  CS
               
               
                  Úřední věstník Evropské unie
               
               
                  L 112/1
               
            
         
      
      
      NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2017/735
      ze dne 14. února 2017,
      kterým se přizpůsobuje technickému pokroku příloha nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek
      (Text s významem pro EHP)
      EVROPSKÁ KOMISE,
      s ohledem na Smlouvu o fungování Evropské unie,
      s ohledem na nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o zřízení Evropské agentury pro chemické látky, o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení nařízení Rady (EHS) č. 793/93, nařízení Komise (ES) č. 1488/94, směrnice Rady 76/769/EHS a směrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a zejména na čl. 13 odst. 2 uvedeného nařízení,
      vzhledem k těmto důvodům:
      
         
         
         
            
               
                  (1)
               
               
                  Nařízení Komise (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje zkušební metody pro určování fyzikálně chemických vlastností chemických látek, jejich toxicity a ekotoxicity, které se mají používat pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006.
               
            
         
      
      
         
         
         
            
               
                  (2)
               
               
                  Nařízení (ES) č. 440/2008 je nutné v souladu se směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU (3) aktualizovat s cílem zahrnout nové a aktualizované zkušební metody, jež nedávno schválila Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD), aby zohlednila technický pokrok a zajistila snížení počtu zvířat používaných pro pokusné účely. Se zúčastněnými stranami byla tato předloha konzultována.
               
            
         
      
      
         
         
         
            
               
                  (3)
               
               
                  Přizpůsobení technickému pokroku obsahuje dvacet zkušebních metod: jednu novou metodu pro stanovení fyzikálně chemických vlastností, pět nových a jednu aktualizovanou zkušební metodu pro stanovení ekotoxicity, dvě aktualizované zkušební metody pro posouzení osudu a chování v životním prostředí a čtyři nové a sedm aktualizovaných zkušebních metod pro stanovení účinků na lidské zdraví.
               
            
         
      
      
         
         
         
            
               
                  (4)
               
               
                  OECD své pokyny ke zkouškám pravidelně přezkoumává, aby určila zkoušky, které jsou vědecky zastaralé. V rámci tohoto přizpůsobení technickému pokroku se ruší šest zkušebních metod, pro něž byly zrušeny odpovídající pokyny OECD ke zkouškám.
               
            
         
      
      
         
         
         
            
               
                  (5)
               
               
                  Nařízení (ES) č. 440/2008 by proto mělo být odpovídajícím způsobem změněno.
               
            
         
      
      
         
         
         
            
               
                  (6)
               
               
                  Opatření stanovená tímto nařízením jsou v souladu se stanoviskem výboru zřízeného podle článku 133 nařízení (ES) č. 1907/2006,
               
            
         
      
      PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:
      Článek 1
      Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění v souladu s přílohou tohoto nařízení.
      Článek 2
      Toto nařízení vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.
      
         Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.
         V Bruselu dne 14. února 2017.
         
            
               Za Komisi
            
            
               předseda
            
            Jean-Claude JUNCKER
         
      
      
      
         (1)  Úř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1.
      
         (2)  Nařízení Komise (ES) č. 440/2008 ze dne 30. května 2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (Úř. věst. L 142, 31.5.2008, s. 1).
      
         (3)  Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely (Úř. věst. L 276, 20.10.2010, s. 33).
      
      
         PŘÍLOHA
         Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění takto:
         
            
            
            
               
                  
                     1)
                  
                  
                     V části A se doplňuje tato kapitola:
                     „A.25   DISOCIAČNÍ KONSTANTY VE VODĚ (TITRAČNÍ METODA – SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA – KONDUKTOMETRICKÁ METODA)
                     
                     ÚVOD
                     Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 112 (1981).
                     
                        Předpoklady
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Vhodná analytická metoda
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Rozpustnost ve vodě
                              
                           
                        
                     
                     
                        Pomocné informace
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Strukturní vzorec
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Elektrická vodivost v případě konduktometrické metody
                              
                           
                        
                     
                     
                        Použití metody
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Všechny zkušební metody lze provádět s čistými nebo běžně obchodovanými látkami. Měly by být zváženy možné účinky nečistot na výsledky.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Titrační metoda není vhodná pro látky s nízkou rozpustností (viz zkušební roztoky níže).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Spektrofotometrickou metodu lze použít pouze u látek, které mají v disociované a nedisociované formě zřetelně různá absorpční spektra UV/VIS. Tato metoda může být rovněž vhodná pro látky s nízkou rozpustností a pro nekyselé/bazické disociace, např. komplexotvorné.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 V případech, kdy platí Onsagerova rovnice, lze použít konduktometrickou metodu, a to i při dosti nízkých koncentracích, a dokonce i v případech nekyselé/bazické rovnováhy.
                              
                           
                        
                     
                     
                        Podklady pro metodu
                     
                     Tato zkušební metoda je založena na metodách uvedených v odkazech v oddíle „Literatura“ a na předběžném návrhu dokumentu Návod pro oznamování před výrobou, EPA, 18. srpna 1978.
                     METODA – ÚVOD, ÚČEL, ROZSAH, RELEVANTNOST, POUŽITÍ A OMEZENÍ ZKOUŠKY
                     Disociace látky ve vodě má význam pro posuzování jejího dopadu na životní prostředí. Závisí na ní forma látky, což určuje její chování a přepravu. Může ovlivňovat absorpci chemické látky do půdy a sedimentů a adsorpci do biologických buněk.
                     
                        Definice a jednotky
                     
                     
                        Disociace je reverzibilní rozdělení molekuly na dvě nebo více chemických látek, které mohou mít charakter iontů. Tento proces obecně vyjadřuje rovnice
                     
                        RX ⇌ R
                        ++ X
                        –
                     
                     a koncentrační rovnovážná konstanta určující reakci je
                     
                        
                     
                     Například v konkrétním případě, kde R je vodík (látkou je kyselina), je tato konstanta
                     
                        
                     
                     nebo
                     
                        
                     
                     
                        Referenční látky
                     
                     Následující referenční látky není nutné používat vždy při zkoušení nové chemické látky. Jsou uvedeny především proto, aby bylo možné čas od času provést kalibraci metody a aby bylo možné porovnat výsledky v případě, že se použije jiná metoda.
                     
                        
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 pKa
                                     (1)
                                 
                              
                              
                                 Teplota v°C
                              
                           
                           
                              
                                 p-nitrofenol
                              
                              
                                 7,15
                              
                              
                                 25 (1)
                                 
                              
                           
                           
                              
                                 kyselina benzoová
                              
                              
                                 4,12
                              
                              
                                 20
                              
                           
                           
                              
                                 p-chloranilin
                              
                              
                                 3,93
                              
                              
                                 20
                              
                           
                        
                     
                     Bylo by užitečné mít látku s několika hodnotami pK, jak je uvedeno níže v oddíle „Princip zkušební metody“. Takovou látkou by mohla být:
                     
                        
                        
                        
                        
                           
                              
                                 kyselina citronová
                              
                              
                                 pKa (8)
                              
                              
                                 Teplota v °C
                              
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 1) 3,14
                              
                              
                                 20
                              
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 2) 4,77
                              
                              
                                 20
                              
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 3) 6,39
                              
                              
                                 20
                              
                           
                        
                     
                     
                        Princip zkušební metody
                     
                     Popisovaný chemický proces je celkově jen mírně závislý na teplotě v teplotním rozpětí, které je běžné v životním prostředí. Ke stanovení disociační konstanty je nutné změřit koncentrace disociované a nedisociované formy chemické látky. Příslušnou konstantu lze stanovit na základě znalosti stechiometrie disociační reakce uvedené výše v oddíle „Definice a jednotky“. V konkrétním případě popsaném v této zkušební metodě se látka chová jako kyselina nebo jako zásada a stanovení se nejpohodlněji provede určením relativních koncentrací iontové a neiontové formy látky a pH roztoku. Vztah mezi těmito pojmy popisuje rovnice pro výpočet pKa v oddíle „Definice a jednotky“ výše. Některé látky vykazují více než jednu disociační konstantu a lze odvodit obdobné rovnice. Některé z metod zde popsaných jsou vhodné také pro nekyselé/bazické disociace.
                     
                        Kritéria kvality
                     
                     
                        Opakovatelnost
                     
                     Stanovení disociační konstanty by se mělo provést opakovaně (minimálně tři stanovení) s tolerancí ± 0,1 log.
                     POPIS ZKUŠEBNÍCH POSTUPŮ
                     Existují dvě základní metody pro stanovení pKa. Jedna zahrnuje titraci známého množství látky se standardní kyselinou nebo případně zásadou; druhá zahrnuje stanovení relativní koncentrace ionizované a neionizované formy a její závislosti na pH.
                     
                        Příprava
                     
                     Metody založené na těchto zásadách lze rozdělit na titrační, spektrofotometrické a konduktometrické.
                     
                        Zkušební roztoky
                     
                     Při titrační metodě a konduktometrické metodě by chemická látka měla být rozpuštěna v destilované vodě. Při spektrofotometrické a jiných metodách se používají pufrované roztoky. Koncentrace zkoušené chemické látky by neměla přesahovat 0,01 M nebo polovinu saturační koncentrace, podle toho, která z hodnot je nižší, a pro přípravu roztoku by měla být použita nejčistší dostupná forma látky. Je-li látka jen mírně rozpustná, může být před přípravou výše uvedených koncentrací rozpuštěna v malém množství rozpouštědla mísitelného s vodou.
                     Roztoky by měly být za využití Tyndallova jevu zkontrolovány na přítomnost emulzí, zejména pokud byl použit kosolvent pro zvýšení rozpustnosti. Použijí-li se pufrované roztoky, neměla by koncentrace pufru přesáhnout 0,05 M.
                     
                        Podmínky zkoušky
                     
                     
                        Teplota
                     
                     Teplota by měla být regulována s přesností nejméně ± 1°C. Stanovení by se mělo provádět při 20 °C.
                     Existuje-li podezření na významnou závislost na teplotě, mělo by být stanovení prováděno alespoň při dvou jiných teplotách. Teplotní intervaly by v tomto případě měly být 10 °C a regulace teploty ± 0,1 °C.
                     
                        Analýzy
                     
                     Metoda bude určována povahou látky, která se testuje. Musí být dostatečně citlivá, aby umožňovala stanovení různých druhů chemických látek při každé koncentraci zkušebního roztoku.
                     
                        Provedení zkoušky
                     
                     
                        Titrační metoda
                     
                     Zkušební roztok se testuje titrací se standardním roztokem zásady nebo případně kyseliny, přičemž po každém přidání titračního roztoku se změří pH. Před dosažením bodu ekvivalence by měl být roztok přidán v rostoucích objemech alespoň desetkrát. Je-li rovnováhy dosaženo dostatečně rychle, může se použít záznamový potenciometr. Pro tuto metodu musí být přesně známo celkové množství látky a její koncentrace. Je nutné vyloučit oxid uhličitý. Podrobnosti postupu, preventivní opatření a výpočet jsou uvedeny ve standardních zkouškách, např. v položkách (1), (2), (3) a (4) seznamu literatury.
                     
                        Spektrofotometrická metoda
                     
                     Vlnová délka se zjistí, pokud ionizovaná a neionizovaná forma látky má znatelně rozdílné absorpční koeficienty. Absorpční spektrum UV/VIS se zjistí z roztoků o konstantní koncentraci za takové hodnoty pH, kde je látka v podstatě neionizovaná, kde je plně ionizovaná a při několika mezilehlých hodnotách pH. Toho lze dosáhnout buď přidáním podílů koncentrované kyseliny (zásady) do poměrně velkého objemu roztoku látky v mnohosložkovém pufru, nejprve při vysoké (nízké) hodnotě pH (viz položka 5 seznamu literatury), anebo přidáním stejných objemů zásobního roztoku látky např. ve vodě nebo v methanolu ke konstantním objemům různých pufrovaných roztoků, jež pokrývají žádoucí rozpětí hodnot pH. Z hodnot pH a hodnot absorbance při zvolené vlnové délce se vypočítá dostatečný počet hodnot pKa za použití alespoň 5 hodnot pH, kdy je látka ionizována z nejméně 10 % a z méně než 90 %. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v odborné literatuře (1).
                     
                        Konduktometrická metoda
                     
                     Pomocí elektrického článku o nízké, známé článkové konstantě se změří vodivost přibližně 0,1 M roztoku látky ve vodivostní vodě. Změří se rovněž vodivost několika přesně připravených zředění tohoto roztoku. Koncentrace se pokaždé sníží na polovinu a celá série by měla pokrývat koncentrace nejméně v rozsahu jednoho řádu. Mezní vodivost při nekonečném zředění se zjistí provedením obdobného pokusu se sodnou solí a extrapolací. Míru disociace pak lze vypočítat z vodivosti každého roztoku pomocí Onsagerovy rovnice, a disociační konstantu je tedy možné vypočítat pomocí Ostwaldova zřeďovacího zákona jako K = α2C/(1 – α), kde C je koncentrace v molech na litr a α je disociovaná frakce. Je nutné vyloučit CO2. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v normách a odborné literatuře (1), (6) a (7).
                     ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV
                     
                        Zpracování výsledků
                     
                     
                        Titrační metoda
                     
                     Vypočítá se pKa pro 10 měřených bodů na titrační křivce. Vypočítá se střední hodnota těchto hodnot pKa a směrodatná odchylka. Měl by být přiložen graf závislosti hodnot pH na objemu standardní zásady nebo kyseliny spolu s vyjádřením v tabulce.
                     
                        Spektrofotometrická metoda
                     
                     Hodnoty absorbance a pH v každém spektru se uvedou v tabulce. Z mezilehlých údajů ve spektrech se vypočítá alespoň pět hodnot pKa a vypočte se rovněž střední hodnota těchto výsledků a směrodatná odchylka.
                     
                        Konduktometrická metoda
                     
                     Vypočítá se ekvivalentní vodivost Λ pro každou koncentraci kyseliny a pro každou koncentraci směsi jednoho ekvivalentu kyseliny plus 0,98 ekvivalentu hydroxidu sodného bez uhličitanů. Přebytek kyseliny má zabránit přebytku OH– v důsledku hydrolýzy. Hodnota 1/Λ se vynese do grafu v závislosti na √C a hodnotu Λo soli lze stanovit extrapolací na nulovou koncentraci.
                     Hodnotu Λo kyseliny lze vypočítat pomocí hodnot H+ a Na+ uvedených v odborné literatuře. Hodnotu pKa je možné vypočítat z α = Λi /Λo a Ka = α2C/(1 – α) pro každou koncentraci. Přesnější hodnoty Ka lze získat provedením úprav na mobilitu a aktivitu. Měla by se vypočítat střední hodnota a směrodatné odchylky z hodnot pKa.
                     
                        Závěrečná zpráva
                     
                     Předložit by se měly všechny naměřené údaje a vypočítané hodnoty pKa spolu s metodou výpočtu (nejlépe ve formě tabulky, jak se doporučuje v položce seznamu literatury (1)) a stejně tak i výše popsané statistické parametry. U titračních metod by měly být uvedeny podrobnosti o standardizaci titračních roztoků.
                     U spektrofotometrické metody by měla být předložena všechna spektra. U konduktometrické metody by měly být uvedeny podrobnosti týkající se stanovení článkové konstanty. Měly by se uvést informace o použitém postupu, analytických metodách a povaze všech použitých pufrů.
                     Měla by se uvést zkušební teplota (teploty).
                     LITERATURA
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 1)
                              
                              
                                 Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 2)
                              
                              
                                 Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, s. 1186–1188 (1969).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 3)
                              
                              
                                 ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 4)
                              
                              
                                 Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 5)
                              
                              
                                 Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 6)
                              
                              
                                 ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 7)
                              
                              
                                 Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (viz výše (4)).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 8)
                              
                              
                                 Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).“
                              
                           
                        
                     
                  
               
            
         
         
            
            
            
               
                  
                     2)
                  
                  
                     V části B se kapitola B.5 nahrazuje tímto:
                     „B.5   AKUTNÍ DRÁŽDIVÉ/LEPTAVÉ ÚČINKY NA OČI
                     
                     ÚVOD
                     Tato metoda je rovnocenná metodě Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 405 (2012). Pokyny OECD pro zkoušení chemických látek jsou pravidelně přezkoumávány s cílem zajistit, aby odrážely nejlepší dostupné vědecké poznatky. Při předchozích přezkumech těchto pokynů pro zkoušení byla zvýšená pozornost věnována možným zlepšením, jichž lze dosáhnout vyhodnocováním veškerých existujících informací o zkoušené chemické látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na laboratorních zvířatech a zohlednit tak zásadu dobrého zacházení se zvířaty. Pokyn pro zkoušení (TG) 405 (přijatý v roce 1981 a aktualizovaný v letech 1987, 2002 a 2012) obsahuje doporučení, aby byla před provedením popsané zkoušky akutních dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo provedena analýza závažnosti důkazů (1) u existujících relevantních údajů. Pokud nejsou dostatečné údaje k dispozici, doporučuje se získat je pomocí metody postupného zkoušení (2) (3). Strategie zkoušení zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek in vitro a je popsána v doplňku této zkušební metody. Pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (REACH) (2) je v příslušném pokynu agentury ECHA uvedena rovněž integrovaná strategie zkoušení (21). Zkoušky na zvířatech by se měly provádět pouze v případě, kdy bylo po posouzení dostupných alternativních metod zjištěno, že tyto zkoušky jsou nezbytné a že použití takových zkoušek je přiměřené. V době přípravy této aktualizované zkušební metody existují případy, kdy použití této zkušební metody je stále nezbytné nebo je podle některých legislativních přístupů vyžadováno.
                     Poslední aktualizace se zaměřila hlavně na použití analgetik a anestetik, aniž by to ovlivnilo základní koncept a strukturu TG 405. Výbor ICCVAM (3) a nezávislá mezinárodní vědecká komise pro odbornou revizi posoudily užitečnost a omezení běžného používání topických anestetik, systémových analgetik a humánních opatření při zkouškách bezpečnosti chemických látek z hlediska jejich dráždivých účinků na oči in vivo (12). Přezkum dospěl k závěru, že použití topických anestetik a systémových analgetik by mohlo z větší části nebo zcela zamezit bolestem a utrpení, aniž by ovlivnilo výsledek zkoušky, a bylo doporučeno, aby tyto látky byly vždy používány. Tato zkušební metoda bere tento posudek v úvahu. Při testování akutních dráždivých a leptavých účinků na oči by se topická anestetika, systémová analgetika a humánní opatření měly používat rutinně. Výjimky z jejich použití by měly být zdůvodněny. Vylepšení popsaná v této metodě podstatně sníží bolest a utrpení zvířat nebo jim zamezí ve většině zkušebních situací, kdy je testování bezpečnosti pro oči in vivo stále nezbytné.
                     Vyvážené preventivní zmírňování bolesti by mělo zahrnovat i) běžné podávání topických anestetik (např. proparacain nebo tetracain) a systémových analgetik (např. buprenorfin) před expozicí, ii) rutinní plán systémové analgezie (např. buprenorfin a meloxicam) v postexpoziční době, iii) plánované prohlídky, sledování a zaznamenávání klinických příznaků bolesti a/nebo utrpení u zvířat a iv) plánované prohlídky, sledování a zaznamenávání povahy, závažnosti a progrese veškerých poškození očí. Další podrobnosti jsou uvedeny v níže popsaných aktualizovaných postupech. Po podání zkoušené chemické látky by další topická anestetika ani analgetika neměla být podávána, aby nedošlo k ovlivnění studie. Analgetika s protizánětlivým působením (např. meloxicam) by neměla být aplikována lokálně a použité dávky by neměly systémově ovlivňovat účinky na oči.
                     Definice jsou uvedeny v dodatku této zkušební metody.
                     VÝCHOZÍ ÚVAHY
                     V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení se zvířaty by se ke zkouškám in vivo nemělo přistupovat, dokud nebyly všechny dostupné údaje významné pro možné leptavé/dráždivé účinky chemické látky na oči vyhodnoceny na základě analýzy závažnosti důkazů. Takové údaje zahrnují důkazy získané z existujících studií na lidech a/nebo laboratorních zvířatech, důkazy leptavých/dráždivých účinků na oči jedné nebo více strukturně příbuzných látek nebo směsí těchto látek, údaje dokládající vysokou kyselost nebo zásaditost chemické látky (4) (5) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek leptavých účinků na kůži a leptavých a dráždivých účinků na oči in vitro nebo ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Tyto studie mohly být vypracovány před analýzou závažnosti důkazů nebo na základě zjištění této analýzy.
                     U některých chemických látek může taková analýza naznačovat nutnost provedení studií možných leptavých/dráždivých účinků chemické látky na oči in vivo. Ve všech takových případech by před zvážením použití oční zkoušky in vivo měla být přednostně nejprve provedena studie leptavých účinků chemické látky na kůži in vitro a/nebo in vivo a vyhodnocena v souladu se strategií postupného zkoušení uvedenou v rámci zkušební metody B.4 (7), nebo v souladu se strategií integrovaného zkoušení, která je popsána v pokynech agentury ECHA (21).
                     Strategie postupného zkoušení, která zahrnuje provedení validovaných zkoušek leptavých/dráždivých účinků na oči in vitro a ex vivo, je popsána v doplňku této zkušební metody a pro účely nařízení REACH v pokynech agentury ECHA (21). Doporučuje se, aby se podle této strategie zkoušení postupovalo před prováděním zkoušek in vivo. U nových chemických látek se doporučuje metoda zkoušení po krocích, díky které lze získat vědecky spolehlivé údaje o leptavých/dráždivých účincích chemické látky. U existujících chemických látek, o jejichž leptavých/dráždivých účincích na kůži a oči není k dispozici dostatek údajů, lze tuto strategii využít pro doplnění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu zkoušení po krocích musí být odůvodněno.
                     PRINCIP ZKOUŠKY IN VIVO
                     
                     Po předchozím ošetření systémovým analgetikem a zavedení vhodného topického anestetika se chemická látka, která má být zkoušena, nanese v jedné dávce na jedno oko pokusného zvířete, přičemž neexponované oko slouží jako kontrola. V předem určených intervalech se na základě lézí spojivky, rohovky a duhovky vyhodnotí stupeň dráždivých/leptavých účinků na oči. Popíší se také jiné účinky na oko a nežádoucí systémové účinky, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo nevratnost účinků.
                     Zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují příznaky značného utrpení a/nebo bolesti nebo léze odpovídající humánním ukazatelům popsaným v této zkušební metodě (viz odstavec 26), se humánně utratí a chemická látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o humánním usmrcení umírajících a značně trpících zvířat lze nalézt v pokynech OECD (8).
                     PŘÍPRAVA NA ZKOUŠKU IN VIVO
                     
                     
                        Výběr druhů
                     
                     Upřednostňovaným laboratorním zvířetem je albinotický králík; používají se zdravá mladá dospělá zvířata. Použití jiných kmenů nebo druhů je třeba zdůvodnit.
                     
                        Příprava zvířat
                     
                     24 hodin před zkouškou se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky, se nepoužijí.
                     
                        Podmínky chovu a krmení
                     
                     Zvířata by měla být chována samostatně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být u králíků 20 °C (± 3 °C). Ačkoli by relativní vlhkost vzduchu měla být minimálně 30 % a pokud možno by kromě doby úklidu místnosti neměla přesáhnout 70 %, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Je třeba se vyvarovat nadměrné intenzity světla. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezeným přísunem pitné vody.
                     POSTUP ZKOUŠKY
                     
                        Použití topických anestetik a systémových analgetik
                     
                     K zamezení nebo minimalizaci bolesti a utrpení při postupech zkoušení bezpečnosti pro oči se doporučují následující postupy. Lze je nahradit alternativními postupy, u nichž bylo zjištěno, že stejně dobře nebo lépe zamezují nebo zbavují bolesti a utrpení.
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Šedesát minut před aplikací zkoušené chemické látky se podkožní injekcí podá buprenorfin v koncentraci 0,01 mg/kg, aby bylo dosaženo terapeutické úrovně systémové analgezie. U buprenorfinu nebo jiných podobných opioidních analgetik podávaných systémově není známo a neočekává se, že by změnily oční reakce (12).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Pět minut před aplikací zkoušené chemické látky se do každého oka aplikují jedna nebo dvě kapky topického očního anestetika (např. 0,5 % proparakain hydrochlorid nebo 0,5 % tetrakain hydrochlorid). Aby se zamezilo možnému ovlivnění studie, doporučuje se topické anestetikum, jež neobsahuje konzervační přípravky. Oko zvířete, které není exponováno zkoušené chemické látce, ale je ošetřeno topickým anestetikem, slouží jako kontrola. Předpokládá-li se, že zkoušená chemická látka způsobuje značnou bolest a utrpení, neměla by být běžně zkoušena in vivo. V případě pochybností, nebo je-li zkoušení nezbytné, by se mělo dbát na doplňkovou aplikaci topického anestetika v pětiminutových intervalech před aplikací zkoušené chemické látky. Uživatelé by si měli být vědomi toho, že vícenásobná aplikace topických anestetik by potenciálně mohla způsobit mírné zvýšení závažnosti účinků a/nebo prodloužení času potřebného k vymizení chemicky indukovaných lézí.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Osm hodin po aplikaci zkoušené chemické látky se subkutánní injekcí podá buprenorfin v koncentraci 0,01 mg/kg a meloxicam v koncentraci 0,5 mg/kg k zajištění trvalé terapeutické úrovně systémové analgezie. Neexistují žádné údaje potvrzující, že meloxicam má, je-li podáván subkutánně jednou denně, protizánětlivé účinky na oči, avšak neměl by se podávat dříve než 8 hodin po aplikaci zkoušené chemické látky, aby se zabránilo případnému ovlivnění studie (12).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Po počátečních 8 hodinách po expozici zkoušené chemické látce by buprenorfin v koncentraci 0,01 mg/kg měl být aplikován subkutánně každých 12 hodin spolu s podáváním meloxicamu v koncentraci 0,5 mg/kg subkutánně každých 24 hodin, dokud oční léze nezmizí a nebudou přítomny žádné klinické příznaky bolesti a utrpení. K dispozici jsou analgetické přípravky s prodlouženým uvolňováním, jejichž použití by mohlo být zváženo ke snížení frekvence dávkování analgetik.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 Pokud předběžná analgezie a topické anestezie nejsou dostačující, je třeba ihned po aplikaci zkoušené chemické látky přikročit k „záchrannému“ tišení bolesti. Jestliže zvíře během zkoušky vykazuje známky bolesti a utrpení, měla by být okamžitě podána „záchranná“ dávka buprenorfinu 0,03 mg/kg subkutánně a opakována v případě potřeby každých 8 hodin, namísto 0,01 mg/kg subkutánně každých 12 hodin. Melixicam 0,5 mg/kg by měl být podáván subkutánně každých 24 hodin spolu se „záchrannou“ dávkou buprenorfinu, avšak ne dříve než minimálně 8 hodin po aplikaci zkoušené chemické látky.
                              
                           
                        
                     
                     
                        Aplikace zkoušené chemické látky
                     
                     Zkoušená chemická látka se aplikuje každému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na jednu sekundu lehce přidrží u sebe, aby nedošlo ke ztrátě látky. Druhé oko, na které se látka neaplikuje, slouží jako kontrola.
                     
                        Výplach
                     
                     Oči pokusných zvířat se do 24 hodin po instilaci zkoušené chemické látky nevyplachují, s výjimkou pevných látek (viz odstavec 18) a okamžitých leptavých nebo dráždivých účinků. Po 24 hodinách je možné v případě potřeby oči vypláchnout.
                     Použití satelitní skupiny zvířat k vyšetření vlivu výplachu očí se nedoporučuje, pokud to není vědecky odůvodněno. Je-li satelitní skupina nezbytná, použijí se dva králíci. Podmínky výplachu se podrobně zdokumentují, např. doba výplachu, složení a teplota promývacího roztoku, trvání, objem a rychlost aplikace.
                     
                        Úroveň dávek
                     
                     1)   Zkoušení kapalin
                     
                     Při zkoušení kapalin se použije dávka 0,1 ml. K instilaci chemické látky přímo do oka by se neměly používat aerosolové rozstřikovače s čerpadlem. Před instilací 0,1 ml do oka by se měla tekutina z rozstřikovače vypudit a shromáždit do nádobky.
                     2)   Zkoušení pevných látek
                     
                     Při zkoušení pevných látek, past a chemických látek obsahujících částice se použije objem 0,1 ml nebo hmotnost nejvýše 100 mg. Zkoušená chemická látka se rozdrtí na jemný prášek. Objem pevného materiálu se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáním odměrnou nádobkou. Pokud nebyla zkoušená pevná chemická látka odstraněna z oka pokusného zvířete pomocí fyziologických mechanismů do doby prvního pozorování po 1 hodině po aplikaci, lze oko vypláchnout fyziologickým roztokem nebo destilovanou vodou.
                     3)   Zkoušení aerosolů
                     
                     Před instilací látek do oka se doporučuje zachytit látky obsažené v rozstřikovačích nebo aerosolech do nádobky. Jedinou výjimkou jsou chemické látky obsažené v aerosolové nádobce pod tlakem, které z důvodu odpařování zachytit nelze. V takových případech se oko podrží otevřené a chemická látka se do oka aplikuje přímým vstříknutím trvajícím jednu sekundu ze vzdálenosti 10 cm. Vzdálenost se může lišit podle tlaku v rozprašovači a jeho obsahu. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození oka tlakem z rozprašovače. Případně bude nutné vyhodnotit možnost „mechanického“ poškození oka v důsledku rozprašovacího tlaku.
                     Odhad dávky z aerosolu lze provést simulací zkoušky takto: látka se nastříká na odvažovací papír otvorem o velikosti králičího oka, který se nachází bezprostředně před papírem. Na základě zvýšení hmotnosti papíru se odhadne množství látky, která se vstříkne do oka. U těkavých chemických látek lze dávku odhadnout pomocí zvážení odběrové nádobky před odstraněním zkoušené chemické látky a po jejím odstranění.
                     
                        Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo na jednom zvířeti)
                     
                     Důrazně se doporučuje, aby se zkouška in vivo provedla zpočátku na jednom zvířeti (viz doplněk této zkušební metody: „Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých účinků na oči“). Na základě pozorování by mělo být možné určit závažnost a vratnost předtím, než se přejde k potvrzující zkoušce na druhém zvířeti.
                     Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že chemická látka má leptavé nebo vysoce dráždivé účinky na oči při použití popsaného postupu, další zkoušení dráždivých účinků na oči se neprovádí.
                     
                        Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na oči in vivo na dalších zvířatech)
                     
                     Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý nebo silně dráždivý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na maximálně dalších dvou zvířatech. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován dráždivý účinek, doporučuje se, doporučuje se provést potvrzující zkoušku metodou postupného zkoušení vždy na jednom zvířeti spíše než exponováním dalších dvou zvířat současně. Pokud se u druhého zvířete projeví leptavé nebo silně dráždivé účinky, ve zkoušce se nepokračuje. Pokud výsledky u druhého zvířete jsou dostačující a umožňují stanovit kategorii nebezpečnosti, žádné další zkoušení se neprovádí.
                     
                        Doba pozorování
                     
                     Doba pozorování by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit míru a vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena vždy, pokud zvíře vykazuje příznaky značné bolesti nebo utrpení (8). Za účelem určení vratnosti účinků by se zvířata měla obvykle pozorovat 21 dnů po podání zkoušené chemické látky. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 21 dnů, zkouška se v tomto okamžiku ukončí.
                     
                        Klinická pozorování a hodnocení očních reakcí
                     
                     Oči by měly být komplexně zhodnoceny na přítomnost či nepřítomnost očních lézí hodinu po aplikaci zkoušené chemické látky a poté alespoň jednou denně. Zvířata by měla být pozorována v prvních třech dnech několikrát denně, aby se zajistilo, že rozhodnutí o utracení budou přijata včas. U zkušebních zvířat by se měly alespoň dvakrát denně po celou dobu studie pravidelně hodnotit na klinické příznaky bolesti a/nebo utrpení (např. opakované škrábání nebo tření oka, nadměrné mrkání, nadměrné slzení) (9) (10) (11) v minimálně šestihodinových nebo v případě potřeby i delších intervalech mezi jednotlivými pozorováními. Je nezbytné i) náležitě posoudit, zda jsou u zvířat patrné známky bolesti a utrpení, aby bylo možno přijmout podložená rozhodnutí, zda je nutné zvýšit dávkování analgetik, a ii) posoudit, zda jsou u zvířat patrné stanovené humánní ukazatele, aby bylo možné přijmout informované rozhodnutí, zda je nutné je humánně utratit, či nikoli, a zajistit, že tato rozhodnutí budou přijata včas. Běžně by se mělo používat zbarvení fluoresceinem a v případě potřeby (např. při posuzování hloubky poškození v případě zvředovatění rohovky) se jako pomůcka při detekci a měření poškození oka a při hodnocení, zda bylo dosaženo stanovených konečných ukazatelů pro humánní utracení, použije ruční štěrbinová lampa. Pro ilustraci lze pořídit digitální fotografie pozorovaných lézí a vést trvalý záznam o rozsahu poškození očí. Jakmile se získají konečné informace, nemělo by zkoušení na zvířatech probíhat déle, než je nezbytné. Zvířata se známkami značných bolesti nebo utrpení se neprodleně humánně utratí a chemická látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí.
                     Humánně se utratí ta zvířata, u nichž došlo po instilaci k těmto očním lézím (popis stupňů lézí viz tabulka 1): perforace rohovky nebo výrazné zvředovatění rohovky včetně stafylomu; krev v přední komoře oční; zákal rohovky stupně 4; absence reakce na osvit (reakce duhovky stupně 2) přetrvávající 72 hodin; zvředovatění spojivkové membrány; nekróza spojivek nebo slzné žlázy; nebo odlupování nekrotické hmoty. Tento postup je dán nevratností takových lézí. Dále se doporučuje použít následující oční léze jako humánní koncové ukazatele pro ukončení studií před uplynutím plánované 21denní doby pozorování. Tyto léze jsou považovány za předpověď závažných dráždivých nebo leptavých poškození a poškození, u nichž se neočekává plná vratnost před ukončením 21denní doby pozorování: značná hloubka poškození (např. zvředovatění rohovky zasahující dále než do povrchových vrstev stromatu), poškození limbu > 50 % (doložené vyblednutím spojivkové tkáně) a silná infekce očí (výtok hnisu). Za užitečné kritérium, jež může ovlivnit klinické rozhodnutí o předčasném ukončení studie, lze také považovat kombinaci vaskularizace povrchu rohovky (tj. pannus, povrchový zánět rohovky), oblastí zbarvených fluoresceinem, které se na základě každodenního posuzování v čase nezmenšují, a/nebo nedostatečné reepitelizace 5 dní po aplikaci zkoušené chemické látky. Jednotlivě však tyto nálezy nejsou dostatečným důvodem k ukončení studie. Jakmile jsou zjištěny závažné účinky na oči, je třeba se obrátit na praktického nebo kvalifikovaného laboratorního veterinárního lékaře nebo osobu odborně způsobilou k identifikaci klinických lézí, aby se provedlo klinické vyšetření, jež stanoví, zda je nutné v důsledku kombinace těchto účinků studii předčasně ukončit. Stupně očních reakcí (spojivek, rohovky a duhovky) by měly být zjišťovány a zaznamenávány po 1, 24, 48 a 72 hodinách od aplikace zkoušené chemické látky (tabulka 1). Zvířata, u nichž oční léze nevzniknou, nelze utratit dříve než 3 dny po instilaci. Zvířata s očními lézemi, které nejsou závažné, se pozorují, dokud léze nevymizí, nebo po 21 dnů, po jejichž uplynutí se studie ukončí. Pozorování, jejichž cílem je stanovit stav lézí a jejich vratnost či nevratnost, by měla být prováděna a zaznamenávána minimálně po 1 hodině, 24 hodinách, 48 hodinách, 72 hodinách, 7 dnech, 14 dnech a 21 dnech. V nezbytných případech by se pozorování mělo provádět častěji s cílem určit, zda by pokusná zvířata měla být z humánních důvodů utracena nebo kvůli negativním výsledkům ze studie vyjmuta.
                     Při každém vyšetření by měly být zaznamenány stupně očních lézí (tabulka 1). Zaznamenány by měly být také jakékoli další oční léze (např. zánět, zbarvení, změny v přední komoře oční) nebo nepříznivé systémové účinky.
                     Vyšetřování reakcí lze usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 hodin mohou být oči zvířat dále vyšetřeny fluoresceinem.
                     Hodnocení reakcí očí je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení reakcí očí a napomoci zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování.
                     ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV
                     
                        Vyhodnocení výsledků
                     
                     Stupně dráždivých účinků na oči se zhodnotí ve spojení s povahou a stupněm závažnosti lézí a jejich vratností nebo nevratností. Jednotlivé stupně nepředstavují absolutní měřítko dráždivých vlastností chemické látky, neboť se hodnotí také jiné účinky zkoušené chemické látky. Jednotlivé stupně by spíše měly být považovány za referenční hodnoty, které jsou smysluplné, pouze pokud se opírají o úplný popis a hodnocení veškerých pozorování.
                     
                        Závěrečná zpráva
                     
                     Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Odůvodnění zkoušení in vivo: analýza závažnosti důkazů u výsledků z dřívějších zkoušek, včetně výsledků strategie postupného zkoušení.
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             popis relevantních údajů z předchozích zkoušek,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje získané v každém kroku strategie zkoušení,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             popis provedených zkoušek in vitro včetně podrobných údajů o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referenčními chemickými látkami,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             popis provedené studie dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo, včetně získaných výsledků,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             analýza závažnosti důkazů odůvodňující provedení studie in vivo.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zkoušená chemická látka:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikační údaje (např. chemický název a, jsou-li k dispozici, číslo CAS, čistota, známé nečistoty, zdroj, číslo šarže),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzikální povaha a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. hodnota pH, těkavost, rozpustnost, stabilita, reaktivita s vodou),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             v případě směsi by mělo být identifikováno její složení včetně identifikačních údajů jejích složek (např. chemické názvy a, jsou-li k dispozici, čísla CAS) a jejich koncentrace,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             aplikovaná dávka.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vehikulum:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikace, koncentrace (podle potřeby), použitý objem,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             zdůvodnění výběru vehikula.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Pokusná zvířata:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý druh/kmen, zdůvodnění použití jiných zvířat, není-li použit albinotický králík,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             stáří každého zvířete na začátku studie,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             počet zvířat každého pohlaví ve zkušebních a kontrolních skupinách (je-li to nutné),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku a na konci zkoušky,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             původ, podmínky chovu, strava atd.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Anestetika a analgetika:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             dávky a doby podání topických anestetik a systémových analgetik,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             je-li použito lokální anestetikum, jeho identifikace, čistota, typ a možná interakce se zkoušenou chemickou látkou.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             popis metody vyhodnocení dráždivosti při každém pozorování (např. ruční štěrbinová lampa, biomikroskop, fluorescein),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje ve formě tabulky o reakcích na dráždivé nebo leptavé účinky u jednotlivých zvířat při každém pozorování až do vyjmutí každého zvířete ze zkoušky,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobný popis stupně a charakteru pozorovaných dráždivých nebo leptavých účinků,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             popis všech dalších pozorovaných očních lézí (např. vaskularizace, tvorba zánětu rohovky, srůst sousedních tkání, zbarvení),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             popis místních a systémových nepříznivých účinků mimo oči, záznam o klinických příznacích bolesti a utrpení, digitální fotografie a případné histopatologické nálezy.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskuse o výsledcích.
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        Interpretace výsledků
                     
                     Extrapolace výsledků studií dráždivých účinků na oči laboratorních zvířat na člověka je platná jen v omezené míře. Albinotický králík je ve většině případů na dráždivé a leptavé látky citlivější než člověk.
                     Je třeba dbát na to, aby byla při interpretaci údajů vyloučena dráždivost pramenící ze sekundární infekce.
                     LITERATURA
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 1)
                              
                              
                                 Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410-429.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 2)
                              
                              
                                 de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 3)
                              
                              
                                 Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 4)
                              
                              
                                 Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 5)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, s. 483-524.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 7)
                              
                              
                                 Kapitola B.4 této přílohy, Akutní dráždivé/leptavé účinky na kůži.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 8)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 9)
                              
                              
                                 Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 10)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 11)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 12)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.
                                 http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 13)
                              
                              
                                 Kapitola B.40 této přílohy, Akutní dráždivé/leptavé účinky na kůži. zkouška transkutánního elektrického odporu (TER).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 14)
                              
                              
                                 Kapitola B.40a této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro: zkouška pomocí modelu lidské kůže.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 15)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 16)
                              
                              
                                 Kapitola B.47 této přílohy, Zkušební metoda pro zákal a propustnost rohovky u skotu pro zjišťování i) chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí a ii) chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 17)
                              
                              
                                 Kapitola B.48 této přílohy, Zkušební metoda odděleného kuřecího oka pro zjišťování i) chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí a ii) chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 18)
                              
                              
                                 U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 19)
                              
                              
                                 UN (2011), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. United Nations Publications.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 20)
                              
                              
                                 Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí, o změně a zrušení směrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o změně nařízení (ES) č. 1907/2006. Úřední věstník Evropské unie L 535, s. 1–1355.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 21)
                              
                              
                                 Agentura ECHA, ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.
                                 http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
                              
                           
                        
                     
                     
                        Tabulka 1
                     
                     
                        Stupnice očních lézí
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 Rohovka
                              
                              
                                 Stupeň
                              
                           
                           
                              
                                 Zákal: stupeň hustoty (vyšetří se nejvíce zakalené oblasti) (*1)
                                 
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Žádné zvředovatění ani zákal
                              
                              
                                 0
                              
                           
                           
                              
                                 Rozptýlené nebo difúzní oblasti zákalu (jiné než slabé zastření normálního lesku), detaily duhovky jasně viditelné
                              
                              
                                 1
                              
                           
                           
                              
                                 Snadno identifikovatelná průhledná oblast, detaily duhovky lehce zastřené
                              
                              
                                 2
                              
                           
                           
                              
                                 Přítomnost zóny opalescence, detaily duhovky nejsou viditelné, velikost zornice stěží rozeznatelná
                              
                              
                                 3
                              
                           
                           
                              
                                 Úplná neprůhlednost rohovky, duhovka je zcela neviditelná
                              
                              
                                 4
                              
                           
                           
                              
                                 Maximální možná hodnota: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Duhovka
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Normální
                              
                              
                                 0
                              
                           
                           
                              
                                 Výrazně prohloubené řasy, městnání, otok, střední překrvení kolem rohovky nebo překrvení při zánětu; rohovka reaguje na světlo (zpožděná reakce je považována za účinek)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                           
                              
                                 Krvácení, makroskopické poškození nebo bez reakce na světlo
                              
                              
                                 2
                              
                           
                           
                              
                                 Maximální možná hodnota: 2
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Spojivky
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Zčervenání (podle nejzávažnější změny pozorované na víčkové nebo bulbární spojivce, kromě rohovky a duhovky)
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Normální
                              
                              
                                 0
                              
                           
                           
                              
                                 Některé krevní cévy hyperemické (překrvené)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                           
                              
                                 Difúzní, rudá barva, jednotlivé cévy nesnadno rozeznatelné
                              
                              
                                 2
                              
                           
                           
                              
                                 Difúzní temně rudá barva
                              
                              
                                 3
                              
                           
                           
                              
                                 Maximální možná hodnota: 3
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Chemóza
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Otoky (týká se víček a/nebo slzných žláz)
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 Normální
                              
                              
                                 0
                              
                           
                           
                              
                                 Slabě abnormální otok
                              
                              
                                 1
                              
                           
                           
                              
                                 Patrný otok, s částečným obrácením víček
                              
                              
                                 2
                              
                           
                           
                              
                                 Otok způsobující uzavření víček zhruba na polovinu
                              
                              
                                 3
                              
                           
                           
                              
                                 Otok způsobující uzavření víček více než na polovinu
                              
                              
                                 4
                              
                           
                           
                              
                                 Maximální možná hodnota: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                        
                     
                     
                        Dodatek
                        DEFINICE
                        
                           
                              Kyselá/alkalická rezerva
                           : U acidních přípravků je to množství (v g) hydroxidu sodného/100 g přípravku, které je nutné k dosažení konkrétní hodnoty pH. U alkalických přípravků je to množství (v g) hydroxidu sodného odpovídající g kyseliny sírové/100 g přípravku, které je nutné k dosažení konkrétní hodnoty pH (Young et al. (1988)).
                        
                           
                              Chemická látka
                           : Chemická substance nebo směs.
                        
                           
                              Nedráždivé látky
                           : Látky, jež nejsou klasifikovány jako látky s dráždivými účinky na oči kategorie I, II, nebo III EPA; nebo jako látky s dráždivými účinky na oči kategorie 1, 2, 2A nebo 2B GHS; nebo jako kategorie 1 nebo 2 EU (17) (18) (19).
                        
                           
                              Látka s leptavými účinky na oči
                           : a) Chemická látka, která způsobuje nevratné poškození oční tkáně; b) chemické látky, jež jsou klasifikovány jako látky s dráždivými účinky na oči kategorie 1 GHS nebo látky s dráždivými účinky na oči kategorie I EPA nebo kategorie 1 EU (17) (18) (19).
                        
                           
                              Látka s dráždivými účinky na oči
                           : a) Chemická látka, která vyvolává vratnou změnu v oku; b) chemické látky, jež jsou klasifikovány jako látky s dráždivými účinky na oči kategorie II nebo III EPA; nebo látky s dráždivými účinky na oči kategorie 2, 2A nebo 2B GHS; nebo kategorie 2 EU (17) (18) (19).
                        
                           
                              Látka se silně dráždivými účinky na oči
                           : a) Chemická látka, která způsobuje poškození oční tkáně, které nezmizí do 21 dnů od aplikace, nebo způsobuje závažné fyzické zhoršení vidění; b) chemické látky, jež jsou klasifikovány jako látky s dráždivými účinky na oči kategorie 1 GHS nebo látky s dráždivými účinky na oči kategorie I EPA nebo kategorie 1 EU (17) (18) (19).
                        
                           
                              Zkoušená chemická látka
                           : Jakákoli chemická substance nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                        
                           
                              Postupný přístup
                           : Strategie postupného zkoušení, kde se všechny existující informace o zkoušené chemické látce přezkoumávají ve stanoveném pořadí s použitím hodnocení závažnosti důkazů na každém stupni, aby se zjistilo, zda jsou k dispozici dostačující informace pro rozhodnutí o klasifikaci nebezpečnosti, než se postoupí do dalšího stupně. Pokud lze potenciál dráždivých účinků zkoušené látky určit na základě existujících informací, další zkoušení není nutné. Jestliže potenciál dráždivých účinků zkoušené látky nelze určit na základě existujících informací, použije se postupný přístup zkoušení na zvířatech po krocích, dokud se nestanoví jednoznačná klasifikace.
                        
                           
                              Závažnost důkazů (postup)
                           : Silné a slabé stránky souboru informací se použijí jako základ pro vyvození závěrů, které z jednotlivých údajů nemusí být zjevné.
                     
                     
                        DOPLNĚK ZKUŠEBNÍ METODY B.5
                         (4)
                     
                     STRATEGIE POSTUPNÉHO ZKOUŠENÍ DRÁŽDIVÝCH A LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA OČI
                     
                        Obecné informace
                     
                     V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení se zvířaty je důležité vyhýbat se zbytečnému používání zvířat a minimalizovat jakékoli zkoušky, které u zvířat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace týkající se potenciálních dráždivých/leptavých účinků chemické látky na oči by se měly zhodnotit před zvažováním zkoušení in vivo. Může již existovat dostatek důkazů pro klasifikaci zkoušené chemické látky podle jejích potenciálních dráždivých nebo leptavých účinků na oči, aniž by bylo nutné provádět zkoušky na laboratorních zvířatech. Proto využití analýzy závažnosti důkazů a strategie postupného zkoušení sníží potřebu provádět zkoušení in vivo, zejména pokud chemická látka pravděpodobně vyvolá závažné reakce.
                     Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých a leptavých účinků chemické látky na oči zhodnotily pomocí analýzy závažnosti důkazů, na jejímž základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu měly provést další studie, jiné než oční studie in vivo. Jsou-li nutné další studie, doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a jejím prostřednictvím získat relevantní experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by se měla strategie postupného zkoušení využít k získání údajů, které jsou nezbytné k vyhodnocení jejich leptavých nebo dráždivých účinků na oči. Původní strategie zkoušení popsaná v tomto doplňku byla vypracována na semináři OECD (1). Následně byla tato strategie potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném systému klasifikace nebezpečnosti chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu na životní prostředí, který schválilo 28. společné zasedání Výboru pro chemické látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998 (2) a aktualizovala skupina odborníků OECD v roce 2011.
                     Ačkoliv tato strategie zkoušení není nedílnou součástí zkušební metody B.5, vyjadřuje doporučovaný postup stanovení dráždivých/leptavých účinků na oči. Tento postup představuje nejlepší praktický i etický standard pro zkoušení dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo. Zkušební metoda obsahuje pokyny pro provádění zkoušky in vivo a shrnuje faktory, kterým je nutno před zvažováním takové zkoušky věnovat pozornost. Strategie postupného zkoušení představuje přístup posuzování stávajících údajů o dráždivých a leptavých účincích chemických látek na oči a odstupňovaný přístup k získávání relevantních údajů o chemických látkách, u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž žádné studie nebyly doposud provedeny. Zkušební strategie zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek in vitro a ex vivo a poté, za specifických okolností, provedení studie zkušební metodou B.4 (3) (4).
                     
                        Popis strategie zkoušení po krocích
                     
                     Před zahájením zkoušek v rámci strategie postupného zkoušení (viz obrázek) se vyhodnotí veškeré dostupné informace, aby se mohlo rozhodnout o nutnosti provést zkoušku na očích in vivo. Ačkoliv lze podstatné informace získat z vyhodnocení jednotlivých parametrů (např. extrémní hodnota pH), stávající informace by se měly hodnotit jako celek. Všechny relevantní údaje o účincích zkoušené chemické látky a jejích strukturních obdob se vyhodnotí na základě rozhodnutí založeného na posouzení závažnosti důkazů a toto rozhodnutí se zdůvodní. Zvláštní důraz by měl být kladen na již existující údaje o účincích chemické látky na člověka a na zvířata a dále na výsledky zkoušení in vitro nebo ex vivo. Studie žíravých chemických látek in vivo by se měly provádět co nejméně. Mezi faktory uvedené ve strategii zkoušení patří:
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 Hodnocení existujících údajů o účincích látky na člověka a/nebo na zvířata a/nebo údajů z validovaných a mezinárodně uznaných metod in vitro (krok 1).
                                 Nejprve je nutné vzít v úvahu existující údaje o účincích na člověka, např. klinické studie a studie nemocí z povolání, záznamy subjektů hodnocení a/nebo údaje o zkouškách na zvířatech získané z očních studií a/nebo údaje z validovaných a mezinárodně uznaných metod zkoušení dráždivých/leptavých účinků na oči in vitro, protože z těchto dat lze získat informace přímo se vztahující k účinkům na oči. Poté se zhodnotí dostupné údaje ze studií na lidech a/nebo na zvířatech zabývajících se leptavými/dráždivými účinky na kůži a/nebo ze studií leptavých účinků na kůži in vitro provedených validovanými a mezinárodně uznanými metodami. Chemické látky, jejichž leptavé nebo vysoce dráždivé účinky na oči jsou známy, se do očí zvířat neaplikují. To platí rovněž pro chemické látky vykazující leptavé nebo dráždivé účinky na kůži; takové látky se považují za látky s leptavými a/nebo dráždivými účinky rovněž na oči. Chemické látky, o nichž byly v předchozích očních studiích získány dostatečné důkazy, že jsou nežíravé a nedráždivé, se v očních studiích in vivo také nezkoušejí.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 Analýza vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou (SAR) (krok 2).
                                 Vezmou se v úvahu výsledky zkoušek strukturně příbuzných chemických látek, jsou-li k dispozici. Pokud jsou k dispozici dostatečné údaje o účincích strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí na člověka a/nebo zvířata naznačující, že mají potenciál leptavých/dráždivých účinků na oči, lze předpokládat, že zkoušená chemická látka vyvolá stejné reakce. V takových případech není nutné tuto chemickou látku zkoušet. Negativní údaje získané ze studií strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí nezakládají podle strategie postupného zkoušení dostatečný důkaz nežíravosti/nedráždivosti látky. Ke stanovení potenciálu leptavých/dráždivých účinků na kůži a oči by měly být použity validované a uznané postupy vycházející z analýzy SAR.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (krok 3).
                                 Chemické látky vykazující extrémní hodnoty pH jako ≤ 2,0 nebo ≥ 11,5 mohou mít silné místní účinky. Pokud se leptavé nebo dráždivé účinky látky na oči stanoví na základě extrémních hodnot pH, lze také vzít v úvahu kyselou/alkalickou rezervu (pufrační kapacitu) (5) (6) (7). Pokud lze podle pufrační kapacity soudit, že chemická látka zřejmě nemá leptavé účinky na oči (tj. chemické látky s extrémní hodnotou pH a nízkou kyselou/alkalickou rezervou), musí tento předpoklad potvrdit další zkoušky, pokud možno s využitím validované a uznané zkoušky in vitro nebo ex vivo (viz odstavec 10).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 Zvážení dalších existujících informací (krok 4).
                                 V této fázi se vyhodnotí veškeré dostupné informace o systémové toxicitě dermální cestou. Vezme se v úvahu také akutní dermální toxicita zkoušené chemické látky. Pokud se u zkoušené chemické látky ukázalo, že je při podání dermální cestou vysoce toxická, není nutné zkoušet ji na oku. Ačkoliv mezi akutní dermální toxicitou a dráždivými/leptavými účinky na oči nemusí nutně existovat souvislost, lze se domnívat, že pokud je látka při podání dermální cestou vysoce toxická, bude vysokou toxicitu vykazovat také při instilaci do oka. Takové údaje lze posoudit také mezi kroky 2 a 3.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 Posouzení leptavých účinků chemické látky na kůži, je-li vyžadováno také pro účely regulace (krok 5).
                                 Potenciál leptavých a silně dráždivých účinků na kůži by měl být nejprve vyhodnocen podle zkušební metody B.4 (4) a jejího doplňku (8), a to včetně použití validovaných a mezinárodně uznaných metod in vitro zkoušení leptavých účinků na kůži (9) (10) (11). Ukáže-li se, že chemická látka vyvolává leptavé nebo silně dráždivé účinky na kůži, lze mít také za to, že má leptavé nebo silně dráždivé účinky na oči. Další zkoušení by tak nebylo nutné. Pokud chemická látka leptavé nebo silně dráždivé účinky na kůži nemá, oční zkouška in vitro nebo ex vivo se provede.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 Výsledky zkoušek in vitro nebo ex vivo (krok 6).
                                 Chemické látky, které vykazovaly leptavé nebo silně dráždivé vlastnosti ve zkoušce in vitro nebo ex vivo (12) (13), která byla validována a mezinárodně uznána pro hodnocení výlučně leptavých/dráždivých účinků na oči, není nutné zkoušet na zvířatech. Lze předpokládat, že takové chemické látky vyvolají ve zkoušce in vivo podobné závažné účinky. Nejsou-li validované a uznané zkoušky in vitro / ex vivo k dispozici, krok 6 se přeskočí a přejde se přímo ke kroku 7.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 Zkouška in vivo na králících (kroky 7 a 8).
                                 Oční zkoušení in vivo se zahájí počáteční zkouškou na jednom zvířeti. Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že chemická látka má silně dráždivé nebo leptavé účinky na oči, další zkoušení se neprovádí. Pokud zkouška žádné leptavé nebo silně dráždivé účinky neodhalí, provede se potvrzující zkouška na dvou dalších zvířatech. Podle výsledků potvrzující zkoušky mohou být nutné další zkoušky (viz zkušební metoda B.5).
                              
                           
                        
                     
                     
                        STRATEGIE ZKOUŠENÍ A HODNOCENÍ DRÁŽDIVÝCH/LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA OČI
                     
                     
                        
                        
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Aktivita
                                 
                              
                              
                                 
                                    Nález
                                 
                              
                              
                                 
                                    Závěr
                                 
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    1
                                 
                              
                              
                                 Existující údaje o účincích látky na lidské nebo zvířecí oči a/nebo údaje z validovaných a mezinárodně uznaných metod in vitro
                                 
                              
                              
                                 Závažné poškození očí
                              
                              
                                 Dominantní ukazatel; považována za žíravou pro oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 Dráždivá pro oči
                              
                              
                                 Dominantní ukazatel; považována za dráždivou pro oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 Nežíravá nebo nedráždivá pro oči
                              
                              
                                 Dominantní ukazatel; považována za nedráždivou a nežíravou pro oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 Existující údaje o leptavých účincích na lidskou a/nebo zvířecí kůži a/nebo údaje z validovaných a mezinárodně uznaných metod in vitro
                                 
                              
                              
                                 Leptavé účinky na kůži
                              
                              
                                 Předpoklad leptavých účinků na oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 Existující údaje o silně dráždivých účincích na lidskou a/nebo zvířecí kůži a/nebo údaje z validovaných a mezinárodně uznaných metod in vitro
                                 
                              
                              
                                 Silně dráždivé účinky na kůži
                              
                              
                                 Předpoklad dráždivých účinků na oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    Nejsou k dispozici žádné informace, nebo informace nejsou přesvědčivé
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    2
                                 
                              
                              
                                 Proveďte hodnocení leptavých/dráždivých účinků na oči podle analýzy SAR
                              
                              
                                 Předpoklad závažného poškození očí
                              
                              
                                 Předpoklad žíravosti pro oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 Předpoklad dráždivých účinků na oči
                              
                              
                                 Předpoklad dráždivosti pro oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 Zvažte hodnocení leptavých účinků na kůži podle analýzy SAR
                              
                              
                                 Předpoklad leptavých účinků na kůži
                              
                              
                                 Předpoklad žíravosti pro oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    Nelze stanovit žádné předpoklady, nebo jsou předpoklady nepřesvědčivé nebo negativní
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    3
                                 
                              
                              
                                 Změřte hodnotu pH (pufrační kapacita, je-li významná)
                              
                              
                                 pH ≤ 2 nebo ≥ 11,5 (s vysokou pufrační kapacitou, pokud je významná)
                              
                              
                                 Předpoklad žíravosti pro oči. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    2 < pH < 11,5, nebo pH ≤ 2,0 nebo ≥ 11,5 s nízkou/žádnou pufrační kapacitou, pokud je významná
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    4
                                 
                              
                              
                                 Posuďte systémovou toxicitu dermální cestou
                              
                              
                                 Vysoce toxické při koncentracích, které by byly zkoušeny na očích.
                              
                              
                                 Chemická látka by byla pro zkoušení příliš toxická. Není nutné zkoušet.
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    Takové informace nejsou k dispozici, nebo látka není vysoce toxická
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    5
                                 
                              
                              
                                 Experimentálně vyhodnoťte potenciál žíravých účinků na kůži podle strategie zkoušení uvedené v kapitole B.4 této přílohy, je-li to vyžadováno také pro účely regulace.
                              
                              
                                 Leptavé nebo silně dráždivé účinky
                              
                              
                                 Předpoklad leptavých účinků na oči. Není třeba žádné další zkoušení.
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    Chemická látka není žíravá ani silně dráždivá pro kůži
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    6
                                 
                              
                              
                                 Proveďte validovanou a uznanou zkoušku (zkoušky) účinků na oči in vitro nebo ex vivo
                                 
                              
                              
                                 Leptavé nebo silně dráždivé účinky
                              
                              
                                 Předpoklad leptavých nebo silně dráždivých účinků na oči, pokud lze provedenou zkoušku použít k identifikaci látek s leptavými / silně dráždivými účinky a chemická látka se nachází v oblasti použitelnosti zkoušky. Není třeba žádné další zkoušení.
                              
                           
                           
                              
                                 Dráždivé účinky
                              
                              
                                 Předpoklad dráždivých účinků na oči, pokud lze provedenou zkoušku (zkoušky) použít ke správné identifikaci látek s leptavými, silně dráždivými a dráždivými účinky na oči a chemická látka se nachází v oblasti použitelnosti zkoušky. Není třeba žádné další zkoušení.
                              
                           
                           
                              
                                 Bez dráždivých účinků
                              
                              
                                 Předpoklad nedráždivosti pro oči, pokud lze provedenou zkoušku (zkoušky) použít ke správné identifikaci látek bez dráždivých účinků, pokud lze tyto látky spolehlivě odlišit od chemických látek, které jsou látkami s dráždivými, silně dráždivými nebo leptavými účinky na oči, a pokud se chemická látka nachází v oblasti použitelnosti zkoušky. Není třeba žádné další zkoušení.
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    Validovanou a uznanou zkoušku (zkoušky) účinků na oči in vitro nebo ex vivo nelze k vyvození závěru použít
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    7
                                 
                              
                              
                                 Proveďte počáteční oční zkoušku na králících in vivo na jednom zvířeti
                              
                              
                                 Závažné poškození očí
                              
                              
                                 Považována za dráždivou pro oči. Není třeba žádné další zkoušení.
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    Žádné výrazné poškození, nebo žádná odezva
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                           
                              
                                 
                                    8
                                 
                              
                              
                                 Proveďte potvrzující zkoušku na jednom nebo dalších dvou zvířatech
                              
                              
                                 Žíravá nebo dráždivá
                              
                              
                                 Považována za žíravou nebo dráždivou pro oči. Není třeba žádné další zkoušení.
                              
                           
                           
                              
                                 Nežíravá nebo nedráždivá
                              
                              
                                 Považována za nedráždivou a nežíravou pro oči. Není třeba žádné další zkoušení.
                              
                           
                        
                     
                     LITERATURA
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 1)
                              
                              
                                 OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 2)
                              
                              
                                 OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 3)
                              
                              
                                 Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 4)
                              
                              
                                 Kapitola B.4 této přílohy, Akutní dráždivé/leptavé účinky na kůži.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 5)
                              
                              
                                 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. Chem. In Vitro, 2, 19-26.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, s. 483 – 524.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 7)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 8)
                              
                              
                                 Doplněk kapitoly B.4 této přílohy, Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých účinků na kůži.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 9)
                              
                              
                                 Kapitola B.40 této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro: zkouška transkutánního elektrického odporu (TER).
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 10)
                              
                              
                                 Kapitola B.40a této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro: zkouška pomocí modelu lidské kůže.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 11)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 12)
                              
                              
                                 Kapitola B.47 této přílohy, Zkušební metoda pro zákal a propustnost rohovky u skotu pro zjišťování i) chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí a ii) chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 13)
                              
                              
                                 Kapitola B.48 této přílohy, Zkušební metoda odděleného kuřecího oka pro zjišťování i) chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí a ii) chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí.“
                              
                           
                        
                     
                  
               
            
         
         
            
            
            
               
                  
                     3)
                  
                  
                     V části B se kapitola B.10 nahrazuje tímto:
                     „B.10   ZKOUŠKA NA CHROMOZÓMOVÉ ABERACE U SAVCŮ IN VITRO
                        
                     
                     ÚVOD
                     Tato zkušební metoda je rovnocenná pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 473 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).
                     Zkouška na chromozómové aberace u savců in vitro má identifikovat chemické látky, které způsobují strukturní chromozómové aberace v kultivovaných buňkách savců (2) (3) (4). Rozlišují se dva typy strukturních aberací: chromozómové a chromatidové. Při zkouškách na chromozómové aberace in vitro by mohla vzniknout polyploidie (včetně endoreduplikace). Aneugenní látky mohou vyvolat polyploidii, avšak z polyploidie samotné nevyplývá aneugenický potenciál a může prostě ukazovat na narušení buněčného cyklu nebo na cytotoxicitu (5). Tato zkouška není určena k měření aneuploidie. K detekci aneuploidie by bylo možné doporučit zkoušku na přítomnost mikrojader in vitro (6).
                     Ke zkoušce na chromozómové aberace in vitro mohou být použity stabilizované buněčné linie nebo primární buněčné kultury lidského původu nebo pocházející z hlodavců. Použité buňky by měly být vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stálosti karyotypu (včetně počtu chromozómů) a spontánní četnosti výskytu chromozómových aberací (7). Údaje, které jsou v současné době k dispozici, neumožňují předkládat jednoznačná doporučení, avšak naznačují, že při hodnocení chemické nebezpečnosti je důležité zvážit stav p53, genetickou stálost (stálost karyotypu), reparační schopnost DNA a původ buněk (lidské versus pocházející z hlodavců) vybraných ke zkoušení. Uživatelům této zkušební metody se proto doporučuje, aby při detekování indukce chromozómových aberací zvážili vliv těchto i jiných buněčných charakteristik na vlastnosti buněčné linie.
                     Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.
                     VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ
                     Zkoušky prováděné in vitro zpravidla vyžadují použití exogenního zdroje metabolické aktivace, pokud nejsou buňky metabolicky kompetentní s ohledem na zkoušené chemické látky. Systém exogenní metabolické aktivace zcela nenapodobuje podmínky in vivo. Je třeba se zcela vyvarovat podmínek, které by vedly k falešným pozitivním výsledkům, tj. k poškození chromozómů, jež není způsobeno přímou interakcí mezi zkoušenou chemickou látkou a chromozómy; takové podmínky zahrnují změny pH nebo osmolality (8) (9) (10), interakce se složkami média (11) (12) nebo nadměrné úrovně cytotoxicity (13) (14) (15) (16).
                     Tato zkouška se používá k odhalování chromozómových aberací, jež mohou být výsledkem klastogenního působení. Analýza indukce chromozómových aberací by se měla provádět pomocí buněk v metafázi. Je proto důležité, že buňky by měly dosáhnout mitózy jak v exponovaných, tak v neovlivněných kulturách. Při zkoušení vyráběných nanomateriálů mohou být potřebné určité úpravy metody, které však v této zkušební metodě nejsou popsány.
                     Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.
                     PRINCIP ZKOUŠKY
                     Buněčné kultury lidského a savčího původu jsou vystaveny zkoušené chemické látce za přítomnosti exogenního zdroje metabolické aktivace i bez něho, pokud ovšem nejsou použity buňky s dostatečnou schopností metabolismu (viz odstavec 13). Ve vhodných předem stanovených intervalech po začátku expozice buněčných kultur zkoušené chemické látce se přidá látka zastavující metafázi (např. colcemid nebo kolchicin), buňky se shromáždí, obarví a u buněk v metafázi je mikroskopicky analyzována přítomnost chromozómových a chromatidových aberací.
                     POPIS METODY
                     
                        Příprava
                     
                     
                        Buňky
                     
                     Mohou být použity různé buněčné linie (např. vaječník křečka čínského (CHO), plíce křečka čínského V79, plíce křečka čínského (CHL/IU, TK6) nebo primární buněčné kultury včetně lymfocytů periferní krve člověka nebo jiných savců (7). Volba buněčných linií by měla být odborně zdůvodněna. Použijí-li se primární buňky, mělo by se vzhledem k ochraně pokusných zvířat, tam, kde je to možné, zvážit použití primárních buněk lidského původu. V takovém případě se odběr vzorků provede v souladu s etickými zásadami a předpisy platnými pro člověka. Lymfocyty periferní krve člověka by měly být získány od mladých (přibližně ve věku 18–35 let) nekuřáků, o nichž není známo, že by trpěli nemocemi nebo že by byli nedávno vystaveni genotoxickým činitelům (např. chemickým látkám, ionizujícímu záření) na úrovních, které by mohly zvýšit spontánní výskyt chromozómových aberací. Tím by se mělo zajistit, že spontánní výskyt chromozómových aberací bude nízký a stálý. Spontánní výskyt chromozómových aberací se s věkem zvyšuje a tento trend je více patrný u žen než u mužů (17) (18). Pokud se společně používají buňky pocházející od více než jednoho dárce, měl by být počet dárců uveden. Je nezbytné prokázat, že buňky se dělily od počátku ošetření zkoušenou chemickou látkou až do odběru buněk k analýze. Buněčné kultury jsou udržovány ve fázi exponenciálního růstu buněk (buněčné linie) nebo jsou stimulovány k dělení (primární kultury lymfocytů), aby bylo možné exponovat buňky v různých stadiích buněčného cyklu, protože citlivost stadií na zkoušené chemické látky nemusí být známa. Primární buňky, které k dělení potřebují stimulaci mitogenními látkami, během expozice zkoušené chemické látce již zpravidla nejsou dále synchronizovány (např. lidské lymfocyty po 48hodinové mitogenní stimulaci). Použití synchronizovaných buněk v průběhu expozice se nedoporučuje, avšak lze je akceptovat v odůvodněných případech.
                     
                        Média a kultivační podmínky
                     
                     Pro udržování kultur by mělo být použito vhodné kultivační médium a inkubační podmínky (kultivační nádoby, případně zvlhčená atmosféra s 5 % CO2, inkubační teplota 37 °C). U buněčných linií by se měla pravidelně kontrolovat stabilita modální hodnoty počtu chromozómů a mělo by se zjišťovat, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty (7) (19). Pokud jsou kultury kontaminované nebo se modální hodnota počtu chromozómů změnila, neměly by se dotyčné kultury používat. Pro buněčné linie nebo primární kultury použité ve zkušební laboratoři by měla být stanovena normální délka buněčného cyklu, která by měla být v souladu s buněčnými charakteristikami uvedenými v literatuře (20).
                     
                        Příprava kultur
                     
                     Buněčné linie: buňky se pomnoží z kmenových kultur, nasadí se do kultivačního média v takové hustotě, aby u buněk v suspenzích nebo v monovrstvách pokračoval exponenciální růst až do sběru buněk (např. mělo by se zamezit konfluenci u buněk rostoucích v monovrstvách).
                     Lymfocyty: krev ošetřená antikoagulantem (např. heparinem) nebo oddělené lymfocyty se kultivují (např. po dobu 48 hodin u lidských lymfocytů) za přítomnosti mitogenu [např. fytohemaglutinin (PHA) u lidských lymfocytů], aby se indukovalo dělení buněk před expozicí zkoušené chemické látce.
                     
                        Metabolická aktivace
                     
                     Při použití buněk, které mají nedostatečnou endogenní metabolickou schopnost, by se měly použít exogenní metabolizující systémy. Nejčastěji používaným systémem, který je standardně doporučován, pokud není zdůvodněno použití jiného systému, je postmitochondriální frakce (S9) doplněná kofaktory. Tato frakce se připravuje z jater hlodavců (zpravidla potkanů) exponovaných látkami indukujícími enzymy, jako je Aroclor 1254 (21) (22) (23) nebo kombinace fenobarbitalu a β-naftoflavonu (24) (25) (26) (27) (28) (29). Posledně jmenovaná kombinace není v rozporu se Stockholmskou úmluvou o perzistentních organických znečišťujících látkách (30) a bylo prokázáno, že je stejně účinná jako Aroclor 1254 pro indukování oxidáz se smíšenou funkcí (24) (25) (26) (28). Frakce S9 je v konečném testovacím médiu obvykle používána v koncentracích od 1 % do 2 % obj., ale koncentraci je možné zvýšit až na 10 %. V průběhu aplikace by se neměly používat látky, jež snižují mitotický index, zejména látky, které tvoří komplexy s vápníkem (31). Volbu typu a koncentrace systému exogenní metabolické aktivace nebo metabolického induktoru, který se použije, je třeba provádět s ohledem na typ zkoušených chemických látek
                     
                        Příprava zkoušené chemické látky
                     
                     Pevné zkoušené chemické látky by měly být před aplikací na buňky rozpuštěny ve vhodných rozpouštědlech a popřípadě zředěny (viz odstavec 23). Kapalné zkoušené látky mohou být přidány přímo k testovacímu systému a/nebo mohou být před aplikací zředěny. Plynné a těkavé zkoušené chemické látky by se měly zkoušet za použití vhodně upravených standardních protokolů, například prostřednictvím ošetření buněk v neprodyšně uzavřených kultivačních nádobách (32) (33) (34). Zkoušená chemická látka by měla být připravena bezprostředně před aplikací, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.
                     
                        Zkušební podmínky
                     
                     
                        Rozpouštědla
                     
                     Rozpouštědlo by mělo být zvoleno tak, aby optimalizovalo rozpustnost zkoušené chemické látky, aniž by nepříznivě ovlivnilo provádění zkoušky, např. měnilo růst buněk, ovlivňovalo integritu zkoušené chemické látky, reagovalo s kultivačními nádobami, narušovalo systém metabolické aktivace. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodného rozpouštědla (nebo kultivačního média). Dobře zavedenými rozpouštědly jsou například voda nebo dimethylsulfoxid. Podíl organických rozpouštědel by zpravidla neměl být větší než 1 % obj. a podíl vodných rozpouštědel (fyziologického roztoku nebo vody) v konečném expozičním médiu by neměl být větší než 10 % obj. Použijí-li se jiná než dobře zavedená rozpouštědla (např. ethanol nebo aceton), mělo by být jejich použití podloženo údaji o jejich kompatibilitě se zkoušenou chemickou látkou a zkušebním systémem a o tom, že nejsou v použité koncentraci genotoxické. Pokud takové podpůrné údaje neexistují, je důležité zařadit neexponované kontroly (viz dodatek 1) prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné škodlivé nebo klastogenní účinky.
                     
                        Měření buněčné proliferace a cytotoxicity a volba expozičních koncentrací
                     
                     Při stanovení nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky by neměly být použity koncentrace, které jsou schopny vyvolat falešnou pozitivní odpověď, jako např. koncentrace, jež vyvolávají nadměrnou cytotoxicitu (viz odstavec 22), srážení kultivačního média (viz odstavec 23) nebo zřetelné změny pH nebo osmolality (viz odstavec 5). Pokud zkoušená chemická látka v době jejího přidání způsobuje zřetelnou změnu hodnoty pH média, pH může být upraveno pufrováním konečného expozičního média tak, aby nedošlo k falešným pozitivním výsledkům a aby byly zachovány vhodné kultivační podmínky.
                     Provádí se měření buněčné proliferace, aby bylo zajištěno, že dostatečný počet ošetřených buněk prodělal během zkoušky mitózu a že expozice je prováděna při vhodných úrovních cytotoxicity (viz odstavce 18 a 22). Cytotoxicita by měla být stanovena v hlavním experimentu s metabolickou aktivací a bez ní za použití vhodných indikátorů buněčné smrti a růstu. Hodnocení cytotoxicity při předběžné zkoušce může být užitečné a může napomoci k lepšímu určení koncentrací, jež mají být použity při hlavní zkoušce, avšak předběžná zkouška není povinná. Pokud se provede, nemůže nahradit měření cytotoxicity při hlavním experimentu.
                     Vhodnými metodami pro posouzení cytotoxicity v cytogenetických zkouškách jsou relativní zdvojnásobení populace (RPD) nebo relativní nárůst počtu buněk (RICC) (13) (15) (35) (36) (55) (příslušné vzorce viz dodatek 2). V případě dlouhodobé expozice a dobách odběru delších než 1,5násobek normální délky buněčného cyklu po zahájení zkoušky (tj. celkově delších než trojnásobek délky buněčného cyklu) by použití RPD mohlo vést k podhodnocení cytotoxicity (37). Za těchto okolností měření RICC může být lepším ukazatelem nebo v případě použití RPD by hodnocení cytotoxicity po 1,5násobku normální délky buněčného cyklu mohlo být užitečné.
                     U lymfocytů v primárních kulturách je mírou cytotoxických/cytostatických účinků mitotický index (MI), avšak ten je ovlivněn tím, po jaké době od expozice se měří, použitým mitogenem a možným narušením buněčného cyklu. MI je však přijatelný, protože jiné metody stanovení cytotoxicity mohou být obtížné a nepraktické a nemusí platit pro cílovou populaci lymfocytů rostoucích v reakci na stimulaci pomocí PHA.
                     Ačkoli doporučenými parametry cytotoxicity jsou pro buněčné linie RICC a RPD a pro primární kulturu lymfocytů MI, mohly by další užitečné informace poskytnout i jiné ukazatele (např. integrita buněk, apoptóza, nekróza, buněčný cyklus).
                     Měly by se vyhodnotit nejméně tři zkušební koncentrace (nepočítaje v to kontroly s rozpouštědlem a pozitivní kontroly), které splňují kritéria přijatelnosti (vhodná cytotoxicita, počet buněk atd.). Bez ohledu na typy buněk (buněčné linie nebo primární kultury lymfocytů) mohou být pro každou zkušební koncentraci použity buď jednotlivé exponované kultury nebo replikáty.I když je doporučováno použití duplicitních kultur, jednu kulturu lze rovněž akceptovat za předpokladu, že v této jediné kultuře je hodnocen stejný celkový počet buněk jako v duplicitních kulturách. Použití jedné kultury je opodstatněné zejména v případě, že jsou posuzovány více než 3 koncentrace (viz odstavec 31). Výsledky získané z duplicitních nezávislých kultur při dané koncentraci lze pro účely analýzy údajů sloučit (38). U zkoušených látek, jež vykazují malou cytotoxicitu nebo nevykazují žádnou cytotoxicitu, budou obvykle vhodné přibližně dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrací. V případě cytotoxicity by měly zvolené zkušební koncentrace pokrývat rozpětí od koncentrace vyvolávající cytotoxicitu, jak je popsáno v odstavci 22, po koncentrace, při nichž dochází ke střední a nízké cytotoxicitě nebo nedochází k žádné cytotoxicitě. Mnohé zkoušené chemické látky vykazují strmé křivky závislosti odezvy na koncentraci, a aby bylo možné získat údaje při nízké a střední cytotoxicitě nebo podrobně studovat závislost účinku na dávce, může být nezbytné zvolit menší rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a/nebo více než tři koncentrace (ať už pro jednu kulturu, nebo replikáty), zejména v případě kdy je požadován opakovaný experiment (viz odstavec 47).
                     Je-li maximální koncentrace odvozena od cytotoxicity, měla by být nejvyšší koncentrace zvolena tak, aby se dosáhlo 55 ± 5 % cytotoxicity za použití doporučených parametrů cytotoxicity (tj. snížení RICC a RPD u buněčných linií a snížení MI u primárních kultur lymfocytů na 45 ± 5 % u souběžné negativní kontroly). Je třeba dbát na to, aby byly interpretovány pouze ty pozitivní výsledky, které jsou vykazovány při vyšší hranici tohoto rozmezí cytotoxicity 55 ± 5 % (13).
                     V případě špatně rozpustných zkoušených chemických látek, které nejsou cytotoxické při koncentracích nižších, než je jejich rozpustnost, by nejvyšší analyzovaná koncentrace měla na konci expozice zkoušené chemické látce vyvolat zákal nebo sraženinu viditelnou pouhým okem nebo pomocí inverzního mikroskopu. Dokonce i v případech, kdy k výskytu cytotoxicity dochází při koncentracích vyšších, než je rozpustnost, se doporučuje testovat pouze při jedné koncentraci vyvolávající zákal nebo viditelné sraženiny, neboť sraženina může vést k falešným účinkům. Při koncentraci, kdy vzniká sraženina, je třeba dbát na to, aby sraženina nemohla ovlivňovat provádění zkoušky (např. barvení nebo hodnocení). Užitečné může být stanovit rozpustnost v kultivačním médiu před pokusem.
                     Není-li pozorována sraženina nebo omezení cytotoxicity, měla by nejvyšší zkušební koncentrace odpovídat 10 mM, 2 mg/ml nebo 2 μl/ml, podle toho, která z uvedených hodnot je nejnižší (39) (40) (41). Pokud u zkoušené chemické látky není stanoveno její složení, např. u látek s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexních reakčních produktů nebo biologického materiálu (UVCB) (42), přírodního extraktu atd., může v případě nízké cytotoxicity být horní koncentrace vyšší (např. 5 mg/ml), aby se zvýšila koncentrace každé ze složek. Je však třeba poznamenat, že u humánních léčivých přípravků se tyto požadavky mohou lišit (43).
                     
                        Kontroly
                     
                     Pro každý časový interval sběru buněk by měly být použity souběžné negativní kontroly (viz odstavec 15) skládající se ze samotného rozpouštědla v kultivačním médiu a zpracované stejným způsobem jako exponované kultury.
                     Souběžné pozitivní kontroly jsou nutné pro prokázání schopnosti laboratoře identifikovat klastogeny za daných experimentálních podmínek a pro prokázání účinnosti exogenního systému metabolické aktivace, všude kde je to možné. Příklady pozitivních kontrol jsou uvedeny v tabulce 1 níže. V odůvodněných případech mohou být použity jiné pozitivní kontrolní chemické látky. Jelikož zkoušky na buňkách savců in vitro za účelem stanovení genetické toxicity jsou dostatečně standardizované, může se použití pozitivních kontrol omezit na experimenty s kontrolními klastogeny vyžadujícími metabolickou aktivaci. Pokud je provedena souběžně se zkouškou bez aktivace se stejnou dobou trvání expozice, tato jediná odpověď v pozitivní kontrole prokáže činnost metabolického aktivačního systému a citlivost testovacího systému. Dlouhodobá expozice (bez S9) by však měla mít svou vlastní pozitivní kontrolu, protože doba trvání expozice bude odlišná než při zkoušce za použití metabolické aktivace. Každá pozitivní kontrola by měla být použita při jedné nebo více koncentracích, u nichž se očekává, že poskytnou reprodukovatelný a detekovatelný nárůst oproti pozadí, čímž se prokáže citlivost testovacího systému (tj. aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo identita kódovaného preparátu), a reakce by neměla být narušena cytotoxicitou přesahující limitní hodnoty stanovené ve zkušební metodě.
                     
                        Tabulka 1.
                     
                     
                        Referenční chemické látky doporučené pro posouzení způsobilosti laboratoře a pro výběr pozitivních kontrol.
                     
                     
                        
                        
                        
                        
                           
                              
                                 Kategorie
                              
                              
                                 Chemická látka
                              
                              
                                 Registrační číslo CAS
                              
                           
                           
                              1.   Klastogeny působící bez metabolické aktivace
                              
                           
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 methyl-methansulfonát
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 mitomycin C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 4-nitrochinolin-1-oxid
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 cytosin arabinosid
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           
                           
                              2.   Klastogeny vyžadující metabolickou aktivaci
                              
                           
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 benzo[a]pyren
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 cyklofosfamid
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           
                        
                     
                     POSTUP
                     
                        Expozice zkoušené chemické látce
                     
                     Proliferující buňky se vystaví zkoušené chemické látce jak za přítomnosti metabolického aktivačního systému, tak bez něho.
                     
                        Doba sběru buněk
                     
                     Pro důkladné hodnocení, které by bylo zapotřebí pro vyvození závěru o negativním výsledku, by měly být splněny všechny tři následující zkušební podmínky za použití krátkodobé expozice s metabolickou aktivací a bez ní a dlouhodobé expozice bez metabolické aktivace (viz odstavce 43, 44 a 45):
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 buňky by měly být vystaveny zkoušené chemické látce bez metabolické aktivace na dobu 3–6 hodin a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (18),
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 buňky by měly být vystaveny zkoušené chemické látce s metabolickou aktivací na dobu 3–6 hodin a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (18),
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 buňky by měly být vystaveny nepřetržité expozicí bez metabolické aktivace až do odběru v době, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu. Určité chemické látky (např. analogy nukleosidů) lze snáze detekovat při dobách aplikace nebo odběru delších než 1,5násobek délky cyklu (24).
                              
                           
                        
                     
                     V případě, že kterékoli z výše uvedených experimentálních uspořádání vedlo k pozitivní odpovědi, nebude nutné zkoumat kterýkoli z ostatních režimů aplikace.
                     
                        Příprava preparátů pro analýzu chromozómů
                     
                     Do buněčné kultury se obvykle 1–3 hodiny před ukončení kultivace přidá colcemid nebo kolchicin. Pro přípravu preparátů pro analýzu chromozómů se každá buněčná kultura zpracovává zvlášť. Příprava preparátů pro analýzu chromozómů zahrnuje hypotonizaci buněk, fixaci a obarvení buněk. Na konci doby expozice v trvání 3–6 hodin se v monovrstvách mohou vyskytovat mitotické buňky (které se vyznačují okrouhlým tvarem a odchlipováním od povrchu). Jelikož lze tyto mitotické buňky snadno oddělit, mohou být při odstranění média obsahujícího zkoušenou chemickou látku ztraceny. Pokud v době sběru buněk existují důkazy podstatného nárůstu počtu mitotických buněk v porovnání s kontrolami, což pravděpodobně ukazuje na zastavení mitózy, pak by buňky měly být odebrány odstředěním a přidány zpět do kultur, aby se zabránilo ztrátě buněk, u nichž probíhá mitóza a mohou zde vznikat chromozómové aberace.
                     
                        Analýza
                     
                     Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, by měly být před mikroskopickou analýzou chromozómových aberací nezávisle kódovány. Poněvadž při fixaci u částu buněk v metafázi často dochází ke ztrátě chromozómů, měly by tudíž vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu rovném modální hodnotě +/- 2.
                     Aby bylo možno vyhodnotit zkoušenou chemickou látku jako jasně negativní, u každé koncentrace a kontroly by mělo být hodnoceno alespoň 300 dobře rozprostřených metafází. Jsou-li využívány k replikám, mělo by být těchto 300 buněk rovnoměrně rozděleno mezi tyto kultury. Pokud je pro každou koncentraci použita jediná kultura (viz odstavec 21), mělo by být hodnoceno alespoň 300 dobře rozprostřených metafází v této jedné kultuře. Hodnocení 300 buněk má tu výhodu, že se zvyšuje statistická síla zkoušky a navíc budou zřídka pozorovány nulové hodnoty (předpokládá se, že pouze u 5 % buněk) (44). Počet hodnocených metafází lze snížit, je-li pozorován velký počet chromozómových aberací a zkoušená chemická látka je považována za jasně pozitivní.
                     Měly by být hodnoceny buňky se strukturními chromozómovými aberacemi včetně gapů a s vyloučením gapů. Zlomy a gapy jsou definovány v Dodatku 1 podle (45) (46). Chromatidové a chromozómové aberace by měly být zaznamenávány odděleně a klasifikovány podle podtypů (zlomy, výměny). Postupy používané v laboratoři by měly zajistit, aby analýzu chromozómových aberací prováděli dobře odborně připravení hodnotitelé a aby tato analýza byla případně podrobena odborné revizi.
                     Ačkoli je účelem zkoušky detekovat strukturní chromozómové aberace, je důležité zaznamenat četnost výskytu polyploidií a endoreduplikací, jsou-li tyto jevy pozorovány (viz odstavec 2).
                     
                        Způsobilost laboratoře
                     
                     Aby laboratoř prokázala dostatečnou zkušenost s testem před rutinním použitím, měla by provést sérii experimentů s referenčními pozitivními chemickými látkami, jež působí prostřednictvím různých mechanismů, a s různými negativními kontrolami (s použitím různých rozpouštědel/vehikul). Odpovědi těchto pozitivních a negativních kontrol by měly být v souladu s odbornou literaturou. Toto se nepoužije na laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají k dispozici databázi historických údajů, jak je definována v odstavci 37.
                     U vybraných pozitivních chemických látek (viz tabulka 1 v odstavci 26) by měla být testována krátká a dlouhá expozice za nepřítomnosti metabolické aktivace a rovněž krátká expozice za přítomnosti metabolické aktivace, aby byla prokázána způsobilost pro detekci klastogenních chemických látek a stanovení účinnosti systému metabolické aktivace. Rozsah koncentrací by u vybraných chemických látek měl být zvolen tak, aby poskytl opakovatelná zvýšení účinku v jednotlivých koncentracích ve srovnání s úrovní pozadí, aby se tak prokázala citlivost a dynamické rozpětí testovacího systému.
                     
                        Historické kontrolní údaje
                     
                     Laboratoř by měla stanovit:
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 historické rozmezí a distribuci pozitivních kontrolních účinků,
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 historické rozmezí a distribuci negativních kontrolních účinků (neexponovaných kultur, s rozpouštědlem).
                              
                           
                        
                     
                     Při prvním získávání údajů o historické distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by aktuální negativní kontroly v ideálním případě spadat do 95 % rozmezí této distribuce (44) (47). Historická databáze negativních kontrol dané laboratoře by měla být vytvořena na základě nejméně 10 experimentů, nejlépe však by měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. kontrolní diagramy (např.C-charts nebo X-bar charts (48)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje o pozitivních a negativních kontrolách a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“ (44). Další doporučení, jak získat a používat historické údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (47).
                     Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich souladu se stávajícími historickými kontrolními databázemi laboratoře. Jakýkoli větší změna by měla vést k zavedení nové historické kontrolní databáze.
                     Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt buněk s chromozómovými aberacemi z jedné kultury nebo ze souhrnu replikovaných kultur, jak je popsáno v odstavci 21. Výsledky aktuálních negativních kontrol by v ideálním případě měly spadat do 95 % rozmezí distribuce v historické databázi negativních kontrol laboratoře (44) (47). Pokud jsou údaje z aktuálních negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zahrnout do dosavadní distribuce kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existuje důkaz o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 37), a důkaz o tom, že nedošlo k technické nebo lidské chybě.
                     ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV
                     
                        Vyjádření výsledků
                     
                     Měl by se vyhodnotit procentuální podíl buněk se strukturními chromozómovými aberacemi. Chromatidové a chromozómové aberace klasifikované podle podtypů (zlomy, výměny) by měly být uvedeny odděleně spolu s jejich počty a četností v experimentálních a kontrolních kulturách. Gapy se zaznamenávají a uvádějí odděleně, ale nezahrnují se do celkové četnosti výskytu aberací. Zaznamená se procentuální podíl polyploidie a/nebo endoreduplikovaných buněk, pokud jsou pozorovány.
                     Měly by být zaznamenány výsledky souběžného stanovení cytotoxicity u všech exponovaných kultur a negativních a pozitivních kontrolních kultur v hlavních experimentech pro hodnocení aberací.
                     Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé kultury. Všechny údaje by měly být shrnuty ve formě tabulek.
                     
                        Kritéria přijatelnosti
                     
                     Přijetí zkoušky je založeno na následujících kritériích:
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 souběžná negativní kontrola je považována za přijatelnou pro přidání do historické databáze negativních kontrol laboratoře, jak je popsáno v odstavci 39,
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 souběžné pozitivní kontroly (viz odstavec 26) by měly vyvolat odpovědi, které jsou slučitelné s odpověďmi uvedenými v historické databázi pozitivních kontrol, a měly by vyvolat statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou,
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 měla by být splněna kritéria buněčné proliferace při kontrole s rozpouštědlem (odstavce 17 a 18),
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 test je proveden za všech tří popsaných experimentálních uspořádání, pokud jedno z nich nevedlo k pozitivním výsledkům (viz odstavec 28),
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 je analyzovatelný adekvátní počet buněk a koncentrací (odstavce 31 a 21),
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 kritéria pro výběr nejvyšší koncentrace jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 22, 23 a 24.
                              
                           
                        
                     
                     
                        Hodnocení a interpretace výsledků
                     
                     Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud v některé ze zkoumaných experimentálních uspořádání (viz odstavec 28):
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 a)
                              
                              
                                 alespoň jedna ze zkušebních koncentrací vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 b)
                              
                              
                                 pokud je prokázána závislost účinku na dávce pomocí vhodného statistického trend-testu;
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 c)
                              
                              
                                 pokud kterýkoli z výsledků je mimo distribuci historických údajů o negativních kontrolách (např. 95 % kontrolních limitů dle Poissonova rozdělení; viz odstavec 39).
                              
                           
                        
                     
                     Jsou-li splněna všechna tato kritéria, má se za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat chromozómové aberace v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (49) (50) (51).
                     Za předpokladu, že byla splněna všechna kritéria přijatelnosti, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně negativní, pokud za všech zkoumaných experimentálních uspořádání (viz odstavec 28):
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 a)
                              
                              
                                 žádná ze zkušebních koncentrací nevykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 b)
                              
                              
                                 hodnocení pomocí vhodného statistického trend-testu ukáže, že nedochází k nárůstu účinku v závislosti na koncentraci;
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 c)
                              
                              
                                 všechny výsledky spadají do rámce distribuce historických údajů o negativních kontrolách (např. 95 % kontrolních limitů dle Poissonova rozdělení; viz odstavec 39).
                              
                           
                        
                     
                     Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat chromozómové aberace v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému.
                     Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.
                     V případě, že odpověď není ani jasně negativní, ani jasně pozitivní, jak je popsáno výše, nebo s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku, by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším šetřením. Užitečné by mohlo být hodnocení většího počtu buněk (je-li vhodné) nebo provedení opakovaného experimentu, případně s použitím upravených zkušebních podmínek (např. rozsah koncentrací, jiné podmínky metabolické aktivace (např. koncentrace S9 nebo původu S9)).
                     V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daného souboru údajů učinit závěr, zda jsou výsledky pozitivní či negativní, a proto bude učiněn závěr, že odpověď na zkoumanou chemickou látku je neurčitá.
                     Nárůst počtu polyploidních buněk může znamenat, že zkoušená chemická látka má schopnost potlačit mitotické procesy a indukovat numerické chromozómové aberace (52). Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může znamenat, že zkoušené chemické látky mají schopnost potlačit progresi buněčného cyklu (53) (54) (viz odstavec 2). Výskyt polyploidních buněk a buněk s endoreduplikovanými chromozómy by se proto měl zaznamenat odděleně.
                     
                        Závěrečná zpráva
                     
                     Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zkoušená chemická látka:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, číslo šarže a je-li k dispozici, datum použitelnosti,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita zkoušené chemické látky samotné, je-li známa,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle, je-li známa,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             měření pH, případně osmolality a sraženiny v kultivačním médiu, do něhož byla přidána zkoušená chemická látka.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Jednosložková látka:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             chemická identifikace, jako např. název IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChl, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné, atd.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vícesložková látka, UVCB a směsi:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             charakterizovaná v co možná největší míře chemickou identitou (viz výše), kvantitativním zastoupením a důležitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozpouštědlo:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             zdůvodnění volby rozpouštědla,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             měl by se též uvést procentuální podíl rozpouštědla v konečném kultivačním médiu.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Buňky:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a zdroj buněk,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             vlastnosti karyotypu a vhodnost použitého typu buněk,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             nepřítomnost mykoplasmat v případě buněčných linií,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             u buněčných linií informace o délce buněčného cyklu, době zdvojnásobení nebo proliferační index,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             pohlaví dárců krve, věk a další důležité informace o dárci, zda byla použita plná krev nebo separované lymfocyty, použitý mitogen,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             případně počet pasáží v případě buněčných linií,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             metody udržování buněčných kultur v případě buněčných linií,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             modální hodnota počtu chromozómů v případě buněčných linií.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zkušební podmínky:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikace chemické látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka expozice buněk,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrace zkoušené chemické látky vyjádřená jako konečná koncentrace v kultivačním médiu (např. v μg nebo mg/ml nebo mM kultivačního média),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             odůvodnění výběru koncentrací a počtu kultur, včetně např. údajů o cytotoxicitě a mezích rozpustnosti,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             složení média, případně koncentrace CO2, vlhkost,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrace (a/nebo objem) rozpouštědla a zkoumané chemické látky přidaných do kultivačního média,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubační teplota,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubační doba,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             délka expozice,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             doba od expozice do odběru buněk k vyhodnocení,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             případně hustota buněk při nasazení,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a složení použitého metabolického aktivačního systému (zdroj S9, metoda přípravy směsi S9, koncentrace nebo objem směsi S9 a S9 v konečném kultivačním médiu, kontroly jakosti S9),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             chemické látky použité v pozitivních a negativních kontrolách, konečné koncentrace pro jednotlivé podmínky expozice,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             metody přípravy preparátů a použitý postup barvení,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             kritéria přijatelnosti zkoušek,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             kritéria hodnocení aberací,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             počet analyzovaných metafází,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             metody měření cytotoxicity,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             jakékoli doplňkové informace týkající se cytotoxicity a použité metody,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             metody použité ke stanovení pH, osmolality a sraženiny.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             počet exponovaných buněk a počet sklizených buněk v každé kultuře, jestliže byly použity buněčné linie,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             měření cytotoxicity, např. RPD, RICC, MI, případná další pozorování, existují-li,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             v případě buněčných linií informace o délce buněčného cyklu, době zdvojnásobení nebo proliferační index,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             známky srážení a doba k jejich stanovení,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             definice aberací, včetně gapů,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             počet hodnocených buněk, počet buněk s chromozómovými aberacemi a typy chromozómových aberací zvlášť pro každou exponovanou a kontrolní kulturu, včetně gapů a s vyloučením gapů,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             změny ploidie (polyploidní buňky a buňky s endoreduplikovanými chromozómy, uvedené odděleně), byly-li pozorovány,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             pokud možno závislost odezvy na koncentraci,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o souběžné negativní (rozpouštědlo) a pozitivní kontrole (s koncentracemi a rozpouštědly),
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             historické údaje o negativních (rozpouštědlo) a pozitivních kontrolách, s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami a 95 % rozpětím distribuci, stejně jako počet údajů,
                                          
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    
                                    
                                    
                                       
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             statistické analýzy, případné p hodnoty.
                                          
                                       
                                    
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozbor výsledků.
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                  
                              
                              
                                 
                                    Závěry.
                                 
                              
                           
                        
                     
                     LITERATURA
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 2)
                              
                              
                                 Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens“, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, s. 1-29.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 3)
                              
                              
                                 Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), „The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture“ in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, s. 427-432.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 4)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, s. 1-175.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 5)
                              
                              
                                 Muehlbauer, P.A. et al. (2008), „Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, s. 318-327.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 6)
                              
                              
                                 Kapitola B.49 této přílohy: Zkouška na přítomnost mikrojader v buňkách savců in vitro.
                                 
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 7)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 8)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, s. 147-204.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 9)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, s. 297-305.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 10)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, s. 789-886.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 11)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, s. 177-183.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 12)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, s. 439-452.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 13)
                              
                              
                                 Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, s. 191-201.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 14)
                              
                              
                                 Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, s. 1-256.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 15)
                              
                              
                                 Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, s. 36-44.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 16)
                              
                              
                                 Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, s. 316-326.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 17)
                              
                              
                                 Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, s. 305-309.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 18)
                              
                              
                                 Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, s. 95-106.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 19)
                              
                              
                                 Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, s. 261-287.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 20)
                              
                              
                                 Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, s.163-167.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 21)
                              
                              
                                 Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, s. 347-363.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 22)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3–4, s. 173-215.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 23)
                              
                              
                                 Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, s. 83-90.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 24)
                              
                              
                                 Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, s. 277-290.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 25)
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, s. 55–65.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 26)
                              
                              
                                 Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, s. 175-177.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 27)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, s. 85-88.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 28)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, s. 241-261.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 29)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, s. 51-59.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 30)
                              
                              
                                 UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). K dispozici na: http://www.pops.int/.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 31)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, s. 225-8.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 32)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, s. 91-103.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 33)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, s. 795-801.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 34)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, s. 122-130.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 35)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, s. 1-3.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 36)
                              
                              
                                 Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 77-83.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 37)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1–2, s. 86–87.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 38)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 39)
                              
                              
                                 OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. K dispozici na vyžádání.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 40)
                              
                              
                                 Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1–2, s. 32-56.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 41)
                              
                              
                                 Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, s. 36-43.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 42)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 43)
                              
                              
                                 USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. K dispozici na adrese: https://federalregister.gov/a/2012-13774.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 44)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS)“, Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 45)
                              
                              
                                 ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 46)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1990), „Metaphase chromosome aberration assays in vitro“, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 62-86.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, s. 87-90.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 49)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 50)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, s. 1-175.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 51)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 52)
                              
                              
                                 Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, s. 29-46.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 53)
                              
                              
                                 Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, s. 403-413.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 54)
                              
                              
                                 Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, s. 1362-1364.
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 55)
                              
                              
                                 Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, s. 139-149.
                              
                           
                        
                     
                     
                        Dodatek 1
                        DEFINICE
                        
                           
                              Aneuploidie
                           : jakákoli odchylka od normálního diploidního (nebo haploidního) počtu chromozómů o jeden nebo více chromozómů, avšak nikoli o celou sadu (nebo více sad) chromozómů (polyploidie).
                        
                           
                              Apoptóza
                           : programovaná buněčná smrt, která se vyznačuje řadou kroků vedoucích k rozpadu buněk na membránově vázané části, které jsou poté odstraněny fagocytózou nebo rozkladem.
                        
                           
                              Buněčná proliferace
                           : zvyšování počtu buněk v důsledku jejich mitotického dělení.
                        
                           
                              Chemická látka
                           : chemická substance nebo směs.
                        
                           
                              Chromatidový zlom
                           : přerušení jedné chromatidy, při kterém dojde k jasnému odchýlení jedné z chromatid.
                        
                           
                              Chromatidový gap
                           : oblast bez zabarvení (achromatická léze) jedné chromatidy, ve které existuje minimální přerušení chromatidy.
                        
                           
                              Chromatidová aberace
                           : strukturní poškození chromozómu v podobě zlomu jedné chromatidy nebo zlomu a opětného spojení chromatid.
                        
                           
                              Chromozómová aberace
                           : strukturní poškození chromozómu v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž místě.
                        
                           
                              Klastogen
                           : jakákoli chemická látka, která způsobuje strukturní chromozómové aberace v populacích buněk nebo eukaryotických organismů.
                        
                           
                              Koncentrace
                           : odkazuje na konečné koncentrace zkoušené chemické látky v kultivačním médiu.
                        
                           
                              Cytotoxicita
                           : u zkoušek prováděných podle této zkušební metody s použitím buněčných linií se cytotoxicita vyjadřuje jako snížení relativního zdvojnásobení populace (RPD) nebo relativního nárůstu počtu buněk (RICC) u exponovaných buněk v porovnání s negativní kontrolou (viz odstavec 17 a dodatek 2). U zkoušek prováděných podle této zkušební metody s použitím primárních kultur lymfocytů se cytotoxicita vyjadřuje jako snížení mitotického indexu (MI) exponovaných buněk v porovnání s negativní kontrolou (viz odstavec 18 a dodatek 2).
                        
                           
                              Endoreduplikace
                           : proces, při kterém v jádře po S-fázi replikace DNA nedojde k mitóze, nýbrž následuje další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómy se 4, 8, 16 … chromatidami.
                        
                           
                              Genotoxický
                           : obecný termín zahrnující všechny typy poškození DNA nebo chromozómů včetně jejich rozlámání, delecí, aduktů, modifikací a propojení nukleotidů, přestavby, genových mutací, chromozómových aberací a aneuploidie. Ne všechny druhy genotoxických účinků způsobují mutace nebo stálé poškození chromozómů.
                        
                           
                              Mitotický index (MI)
                           : podíl buněk, které se nacházejí v metafázi, z celkového počtu buněk v populaci; udává stupeň proliferace této populace.
                        
                           
                              Mitóza
                           : proces dělení buněčného jádra, který se obvykle člení na profázi, prometafázi, metafázi, anafázi a telofázi.
                        
                           
                              Mutagenní
                           : produkující dědičné změny sekvence (sekvencí) párů bází DNA v genech nebo struktury chromozómů (chromozómové aberace).
                        
                           
                              Numerická aberace
                           : odchylka počtu chromozómů od normálního počtu obvyklého u použitého typu buněk.
                        
                           
                              Polyploidie
                           : numerické chromozómové aberace v buňkách nebo organismech, které se týkají celé sady (celých sad) chromozómů, na rozdíl od jednoho chromozómu nebo jednotlivých chromozómů (aneuploidie).
                        
                           
                              Stav p53
                           : protein p53 se podílí na regulaci buněčného cyklu, apoptózy a reparace DNA. Buňky, jež mají nedostatek funkčního proteinu p53, nejsou schopny zastavovat buněčný cyklus nebo odstraňovat poškozené buňky prostřednictvím apoptózy nebo jiných mechanismů (např. indukcí reparace DNA) souvisejících s funkcemi p53 v reakci na poškození DNA, by teoreticky měly být náchylnější ke genovým mutacím nebo chromozómovým aberacím.
                        
                           
                              Relativní nárůst počtu buněk (RICC)
                           : zvýšení počtu buněk v chemicky ošetřených kulturách oproti zvýšení v neexponovaných kulturách, poměr vyjádřený v procentech.
                        
                           
                              Relativní zdvojnásobení populace (RPD)
                           : zvýšení počtu pozorovaných zdvojnásobení populace v chemicky ošetřených kulturách oproti zvýšení v neexponovaných kulturách, poměr vyjádřený v procentech.
                        
                           
                              S9 jaterní frakce
                           : supernatant homogenátu jater po odstředění při 9 000 g, tj. surový jaterní extrakt.
                        
                           
                              S9 směs
                           : směs S9 jaterní frakce a kofaktorů nezbytných pro metabolickou aktivitu enzymů.
                        
                           
                              Kontrola s rozpouštědlem
                           : obecný termín k označení kontrolních kultur, ke kterým se přidává pouze rozpouštědlo používané k rozpuštění zkoušené chemické látky.
                        
                           
                              Strukturní aberace
                           : mikroskopicky pozorovatelné změny struktury chromozómů při buněčném dělení ve stadiu metafáze; jeví se jako delece a fragmenty, intrachromozómální nebo interchromozómální změny.
                        
                           
                              Zkoušená chemická látka
                           : jakákoli chemická látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.
                        
                           
                              Neexponované kontroly
                           : kultury, které se neexponují (tj. ani chemické látce, ani rozpouštědlu), ale zpracovávají se souběžně stejným způsobem jako kultury, k nimž se se přidává zkoušená chemická látka.
                     
                     
                        Dodatek 2
                        
                           VZORCE PRO HODNOCENÍ CYTOTOXICITY
                        
                        
                           Mitotický index (MI):
                        
                        
                           
                        
                        Doporučuje se použít relativní nárůst počtu buněk (RICC = Relative Increase in Cell Counts) nebo relativní zdvojnásobení populace (RPD = Relative Population Doubling), jelikož oba tyto ukazatele zohledňují poměr buněčné populace, která se rozdělila.
                        
                           
                        
                        
                           
                        
                        kde:
                        
                           Zdvojnásobení populace = [log (počet buněk po expozici ÷ počáteční počet buněk)] ÷ log 2.
                        Například hodnota 53 % RICC nebo RPD označuje 47 % cytotoxicity/cytostáze a 55 % cytotoxicity/cytostáze měřené pomocí MI znamená, že skutečný MI je 45 % kontroly.
                        V každém případě by měl být změřen počet buněk před expozicí a počet buněk v exponované kultuře a v negativní kontrolní kultuře.
                        V minulosti byl jako parametr cytotoxicity užíván RCC (tj. počet buněk v exponovaných kulturách / počet buněk v kontrolních kulturách), nyní se již nedoporučuje, protože může cytotoxicitu podhodnotit.
                        V negativních kontrolních kulturách by mělo být zdvojnásobení populace slučitelné s požadavkem na odběr buněk po takové době od aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu, a mitotický index by měl být natolik vyšší, aby se získal dostatečný počet buněk v mitóze a aby bylo možné spolehlivě vypočítat snížení o 50 %.
                     “
               
            
         
         
            
            
            
               
                  
                     4)
                  
                  
                     V části B se kapitola B.11 nahrazuje tímto:
                     „B.11   Zkouška na chromozómové aberace v buňkách kostní dřeně savců
                     
                     ÚVOD
                     Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 475 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).
                     Zkouška na chromozómové aberace v buňkách kostní dřeně savců in vivo je zvláště významná k posouzení genotoxicity, neboť zde probíhá aktivní metabolismus in vivo, farmakokinetika a procesy reparace DNA, které přispívají k účinku testované látky, jakkoli mohou být různé u různých druhů. Zkouška in vivo je rovněž užitečná pro další výzkum genotoxicity zjištěné v systémech in vitro.
                     Zkouška na chromozómové aberace u savců in vivo je používána pro detekci strukturních chromozómových aberací indukovaných zkoušenou chemickou látkou v buňkách kostní dřeně savců, obvykle hlodavců (2) (3) (4) (5). Rozlišují se dva typy strukturních aberací – chromozómové a chromatidové. U většiny genotoxických chemických látek jsou indukované aberace chromatidového typu, avšak chromozómové aberace se rovněž vyskytují. Poškození chromozómů a související jevy jsou příčinou mnoha geneticky podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho důkazů o tom, že pokud tyto léze a související jevy způsobují změny v onkogenech a v tumor-supresorových genech, mají podíl na indukci rakoviny u člověka a v experimentálních systémech. Při zkouškách na chromozómové aberace in vivo mohou vznikat polyploidie (včetně endoreduplikací). Z nárůstu polyploidie samotné však nevyplývá aneugenický potenciál a může prostě ukazovat na narušení buněčného cyklu nebo na cytotoxicitu. Tato zkouška není určena k detekci aneuploidie. Pro detekci aneuploidie in vivo a in vitro lze doporučit mikronukleus test v savčích erytrocytech in vivo (kapitola B.12 této přílohy) nebo zkoušku in vitro na přítomnost mikrojader v buňkách savců (kapitola B.49 této přílohy).
                     Definice použitých termínů jsou uvedeny v dodatku 1.
                     VÝCHOZÍ ÚVAHY
                     Při této zkoušce jsou běžně používáni hlodavci, avšak v některých případech, je-li to vědecky zdůvodněno, mohou být vhodné i jiné druhy. Cílovou tkání je v této zkoušce kostní dřeň, poněvadž je vysoce vaskularizovanou tkání a obsahuje populaci buněk s rychlým cyklem, které se snadno izolují a zpracovávají. Vědecké zdůvodnění použití jiných druhů než potkanů a myší by mělo být uvedeno ve zprávě. Jsou-li použity jiné druhy než hlodavci, doporučuje se detekci chromozómových aberací v buňkách kostní dřeně začlenit do jiné vhodné zkoušky toxicity.
                     Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená chemická látka (chemické látky) nebo reaktivní metabolit (metabolity) nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.
                     Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.
                     PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
                     Zvířata se vhodným způsobem vystaví zkoušené chemické látce a ve vhodném okamžiku po expozici se humánně utratí. Před utracením se zvířatům podá látka zastavující metafázi (např. kolchicin nebo colcemid). Z buněk kostní dřeně se poté připraví preparáty chromozómů, obarví se a analyzují se chromozómové aberace buněk v metafázi.
                     OVĚŘENÍ ZPŮSOBILOSTI LABORATOŘE
                     
                        Experimenty pro ověření způsobilosti
                     
                     Aby bylo možné před zahájením rutinního zkoušení zjistit, zda laboratoř má s danou zkouškou dostatečné zkušenosti, měla by prokázat schopnost reprodukovat očekávané výsledky z publikovaných údajů (např. (6)), pokud jde o četnost chromozómových aberací, nejméně se dvěma pozitivními kontrolními chemickými látkami (včetně slabých reakcí indukovaných nízkými dávkami u pozitivních kontrol), např. látkami uvedenými v tabulce 1, a s kontrolami s kompatibilním vehikulem/rozpouštědlem (viz odstavec 22). Při těchto experimentech by se měly používat dávky, jež poskytují reprodukovatelné nárůsty v závislosti na dávce, a měly by prokázat citlivost a dynamické rozpětí zkušebního systému ve sledované tkáni (kostní dřeň) za použití hodnotící metody, jež má být v laboratoři uplatňována. Tento požadavek neplatí pro laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají dostupnou databázi historických údajů, jak je definována v odstavcích 10–14.
                     
                        Historické kontrolní údaje
                     
                     V průběhu šetření způsobilosti by laboratoř měla stanovit:
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 historické rozmezí a distribuci pozitivních kontrolních účinků a
                              
                           
                        
                     
                     
                        
                        
                        
                           
                              
                                 —
                              
                              
                                 historické rozmezí a distribuci negativních kontrolních účinků.
                              
                           
                        
                     
                     Při prvním získávání údajů o dosavadní distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by soub